松果体と眼の発生の比較研究による視覚器発生基本メカニズムの解明

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眼と松果体は、個体発生がよく以ており、いわば姉妹器官と言える。松果体は時として第3の眼と呼ばれる構造に発生することもある。しかし、ほ乳類など高等脊椎動物の松果体は内分秘器官であり、形態上、機能上、眼(網膜)との類似性はない。本研究は、系統進化上、松果体発生に何が生じたのかを解析する事によって、器官発生の機構の研究を深化しようとするものである。今年度は、以下の項目について研究した。(1)昨年度行ったトリ胚松果体細胞の解離旋回培養と同様の実験を、今年度はラットを用いて行った。生後すぐのラット松果体を分離し、組織を解離後、旋回培養して再凝集形成条件に置くと、均一のサイズの集合体を形成した。網膜細胞に特異的な抗体により構造を調べると、抗rhodopsin抗体に陽性の視細胞分化、抗Calretinin抗体や抗Pax6抗体に陽性のアマクリン細胞の分化が示された。視細胞は常に表層部に、アマクリン細胞は中層部に分布した。さらに、神経幹細胞マーカーであるNestinの分布を調べると、多数の陽性細胞が見られた。この結果は、ほ乳類松果体には神経幹細胞、特に網膜幹細胞があり、網膜細胞分化能を発現する事を強く示唆している。(2)昨年度に引き続き、トリ胚松果体に遺伝子強制発現する事を試みた。発生中の松果体はきわめて小さく、再現性のあるエレクトロポレーションは困難である。そこで、コラーゲン溶液に目的の遺伝子プラスミドを加え、ゲル化した小片を強制発現する方法を考案した。GFPを用いて調べたところ、効果は高く、優れた方法であることが示された。まだ結果が出ていないが、この手法をいくつかの眼の発生初期に発現する遺伝子(Six3,Otx2,Chx10)に応用した。(3)昨年度開発した松果体原基の器官培養では、形態的にほぼ正常発生過程を再現できる。この培養系で遺伝子導入法を検討した。