破骨細胞に特異的な膜表面抗原遺伝子のクローニングとその機能と解析

破骨细胞特异性膜表面抗原基因的克隆及其功能与分析

基本信息

  • 批准号:
    05671543
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.09万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    1993
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1993 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

破骨細胞の表面にはカルシウム代謝調節ホルモンの一つであるカルシトニンのリセプターが存在し、その骨吸収能を抑制することが知られている。本研究においては、このカルシトニンの破骨細胞に対する親和性を上げる活性を持つモノクローナル抗体Kat 1の膜表面抗原遺伝子のクローニングとその機能解析を行うことを目的とした。まず、ラット骨髄細胞をラット骨芽細胞の培養上清を添加し、活性型ビタミンD3 と共に5日間培養しKat 1抗原を発現する破骨細胞様細胞を大量に調整した。さらに、この細胞集団に、Kat 1モノクローナル抗体を作用させ免疫磁気ビーズ細胞分離システム(MACS)を用いてKat 1抗原を発現する細胞を濃縮した。この細胞からmRNAさらにpolyARNAを調製した。このmRNAを鋳型としてXhoIサイトを含むリンカープライマーを用いて、逆転写酵素及びDNApolymeraseIにより1st strand合成及び2nd strand合成を行いcDNAを合成した。得られたcDNAの末端を平滑化しEcoRIアダプターを付加した。さらに、このアダプターをリン酸化したのち制限酵素XhoIで切断した。この反応物をSephacryl S-400カラムに添加しリンカーの小断片を除いた後、Uni ZAP arm (ストラタジーン社)に挿入し、in vitro pakagingを行いphage libraryを作製した。このファージライブラリーをPlatingし溶菌させた後、蛋白質をニトロセルロースフィルターに吸着させBlocking後Kat 1モノクローナル抗体を作用させた後、Vecterstatin社のABC-AP法に従って現在のところファージクローンを解析中である。
The surface of osteoclast is a complex of metabolic regulators, which can inhibit bone resorption. The aim of this study is to analyze the function of the membrane surface antigen of antibody Kat 1 by increasing the affinity and activity of the osteoclast. The culture supernatant of osteoclast cells was added to the culture supernatant of osteoclast cells, and the expression of Kat 1 antigen in osteoclast cells was greatly adjusted for 5 days. In addition, the cell population, Kat 1, was concentrated by using the Kat 1 antigen to produce cells that had been isolated from the immune system. The mRNA in these cells is modulated with polyARNA. The mRNA is synthesized by the 1st strand and the 2nd strand of DNA. The end of the cDNA was smoothed and the cDNA was extracted. The enzyme XhoI is cut off when the enzyme is removed. The Sephacryl S-400 was added to the reverse phase library, and then the Uni ZAP arm was added to the reverse phase library. The ABC-AP method of Vecterstatin Corporation is used to analyze the protein in the solution after Plating and lysis.

项目成果

期刊论文数量(4)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
A,Kukita: "Induction of mononuclear procurscr cells With osteoclastic phenctypes in a rat bone marrow culture system depleted of stromal colls." Biochem, Biophys. Res. Commun.196. 1383-1389 (1993)
A,Kukita:“在基质胶耗尽的大鼠骨髓培养系统中诱导具有破骨细胞表型的单核前体细胞。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
A,Kukita: "Heat-tleated osteoblastic cell(ROS17/2.8)-Conditioned medium induces the fomation of osicoclast-like colls." Bone and Mineral. 23. 113-127 (1993)
A,Kukita:“热成骨细胞(ROS17/2.8)条件培养基诱导破骨细胞样细胞的形成。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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    0
  • 作者:
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  • 通讯作者:
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