破骨細胞のシグナル伝達制御解明(G蛋白質を介するレセプターキナーゼ遺伝子の解析)

本研究においては、破骨細胞の膜表面に存在するG蛋白質を介したレセプターのレセプターキナーゼのcDNAをクローニングすることを目的とした。そのために、まず、我々が既に作製した破骨細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体Katlに陽性細胞のcDNAライブラリーを用いてクローニングを行うことを試みた。はじめに、このライブラリーが破骨細胞特異的であり、G蛋白質を介したレセプターであるカルシトニンのレセプターを発現しているかどうかを調べた。オーストラリアのDr.Sextonよりラットのカルシトニンレセプター(Cla)のcDNAを頂き、インサートより、polyAを除くプローブを作製し、それを用いてKatl陽性細胞のcDNAライブラリー(約1.5X105)をスクリーニングしたところ、6個の陽性クローンが得られた。この6個の陽性クローンについて、カルシトニンレセプターの膜貫通領域に相当するプライマーを作製し、PCR反応と、そのSouthern hybridizationを行ったところ4つのクローンについて陽性のバンドが得られた。また、これらのクローンについて一部の配列を決定したところ、カルシトニンレセプターの配列と一致した。これらの結果から、このKatl陽性細胞のcDNAライブラリーは、カルシトニンのレセプターを高頻度に発現しており、それをリン酸化するレセプターキナーゼも高頻度の発現していることが考えられた。そこで、既に報告されているヒトのレセプターキナーゼの活性部位のよく保存されている領域から二種類のプライマーを作製した。まず、一つのプライマーを用いてKatl陽性細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとしPCR反応を行った後、その反応液をテンプレートとしさらにもう一つのプライナーを用いてPCR反応を行った。相当する長さのバンドを切り出しpBluscriptにクローニングし、その塩基配列を解析中である。

本研究においては、破骨細胞の膜表面に存在するG蛋白質を介したレセプターのレセプターキナーゼのcDNAをクローニングすることを目的とした。そのために、まず、我々が既に作製した破骨細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体Katlに陽性細胞のcDNAライブラリーを用いてクローニングを行うことを試みた。はじめに、このライブラリーが破骨細胞特異的であり、G蛋白質を介したレセプターであるカルシトニンのレセプターを発現しているかどうかを調べた。オーストラリアのDr.Sextonよりラットのカルシトニンレセプター(Cla)のcDNAを頂き、インサートより、polyAを除くプローブを作製し、それを用いてKatl陽性細胞のcDNAライブラリー(約1.5X105)をスクリーニングしたところ、6個の陽性クローンが得られた。この6個の陽性クローンについて、カルシトニンレセプターの膜貫通領域に相当するプライマーを作製し、PCR反応と、そのSouthern hybridizationを行ったところ4つのクローンについて陽性のバンドが得られた。また、これらのクローンについて一部の配列を決定したところ、カルシトニンレセプターの配列と一致した。これらの結果から、このKatl陽性細胞のcDNAライブラリーは、カルシトニンのレセプターを高頻度に発現しており、それをリン酸化するレセプターキナーゼも高頻度の発現していることが考えられた。そこで、既に報告されているヒトのレセプターキナーゼの活性部位のよく保存されている領域から二種類のプライマーを作製した。まず、一つのプライマーを用いてKatl陽性細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとしPCR反応を行った後、その反応液をテンプレートとしさらにもう一つのプライナーを用いてPCR反応を行った。相当する長さのバンドを切り出しpBluscriptにクローニングし、その塩基配列を解析中である。