PT-PCR法を用いた破骨細胞形成系に関する分子薬理学的研究

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本研究は、活性型ビタミンD3により単球に、TPAによりマクロファージに、レチノイン酸により顆粒球に、更に扁平上皮癌の細胞株(MH-85)のconditioned mediumにより破骨細胞に分化する能力を有するヒト前骨髄細胞様細胞株(HL-60)を用いて、この細胞が単球.マクロファージ、破骨細胞へと分化する過程におけるビオプテリンおよびGTP-シクロヒドロラーゼI(GTP-CHI)の生理的役割を分子薬理学的に検討すると共に、三種の多形の存在が指摘されているGTP-CHIの三種のmRNAの存在比率をこれら血液細胞において検討する事を目的としていた。10%牛胎児血清を含むRPMI1640溶液中5%CO_2存在下,37℃にて3日間培養したHL-60細胞は、活性形ビタミンD_3(1-100nM)、インターフェロン-gamma(1000u/ml)、TPA(100nM)あるいはレチノイン酸(10-1000nM)添加により、それぞれ単球.マクロファージおよび顆粒球に分化した。これら分化したHL-60細胞よりmRNAをAcid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chroloform (AGPC)法により抽出し、これら細胞に発現しているGTP-CHIのmRNAをReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)法にて検出し、それぞれの細胞におけるGTP-CHIの三種のmRNAの存在比率を調べた。その結果HL-60細胞にも肝臓において見いだされた様にGTP-CHIの三種のmRNAの存在が確認できた。また、このGTP-CHIの三種のmRNAの発現は活性型ビタミンD_3(1-100nM)およびインターフェロン-gamma(1000u/ml)により著しく誘導された。一方、TPA(100nM)はこの三種のmRNAの誘導を抑制した。これらの観察より、GTP-CHIのmRNAがこれら血液細胞においても三種存在すること、およびこのGTP-CHIのmRNAが血液細胞の分化に関連している可能性が示された。現在、これら分化したHL-60細胞のホモジネートを作製し、ネオプテリンおよびビオプテリン量、GTP-CHI活性を測定している。