Prevotella loescheiiの免疫抑制因子遺伝子のクローン化と解析

洛氏普氏菌免疫抑制因子基因的克隆与分析

基本信息

  • 批准号:
    05671580
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.28万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    1993
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1993 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Prevotella loescheiiの免疫抑制因子遺伝子のクローニングに先がけて、P.loescheiiから因子の精製をHPLC-DEAE交換クロマトグラフフィーおよびゲルろ過法にて手がけた。溶出分画の免疫抑制活性はヒトリンパ球由来の培養株細胞への^3H-チミジン取り込み能の抑制を指標とした。因子はDEAEイオン交換体に吸着し、抑制活性は0.1〜0.2MNaC1濃度で溶出された。活性分画はゲルろ過法でおよそ32kDaの分子量を示した。32kDa因子は加熱処理およびタンパク質分解酵素処理に感受性であった。このタンパク質性因子はヒトのB細胞由来株細胞(BALL-1)、T細胞由来株細胞(Jurkat)および単球由来株細胞(U937)の^3H-チミジン取り込み能を供与量依存的に抑制した。また、この因子はホルボールエステルにてマクロファージに分化させたU937細胞からのIL-1分泌を抑制、さらに、Jurkat細胞からのIL-2産生抑制を示し、P.loescheiiが宿主の免疫応答を攪乱していることを示唆した。ついで、P.loescheiiからDNAを分離し、E.coli内に遺伝子バンクを作製した。このバンクからP.loescheiiの免疫抑制因子遺伝子クローンを因子タンパク質に対する抗血清で免疫学的にスクリーニングする予定であった。この時点で、因子タンパク質を精製する過程で、P.loescheiiの培養用培地中に含有されるBactopeptoneあるいはYeast extractsに由来するタンパク質と、因子タンパク質との凝集が生じてきているとの疑問を持つようになった。したがって、免疫学的に因子タンパク質クローンをスクリーニングすることは不可能となった。方法を転じて、cytolysin等、既報の塩基配列からオリゴヌクレオチドプローブをPCR法にて作製し、このプローブとハイブリダイズするP.loescheiiクローンをスクリーニングする方法を施行している。
The cloning of Prevotella loescheii's immunosuppressive factor gene and the purification of P. loescheii's kappa factor were carried out by HPLC-DEAE exchange cloning and labeling methods. Immunosuppressive activity of the dissolution assay is an indicator of the inhibitory activity of the cells derived from the culture of the ball. Factor DEAE exchange system adsorption, inhibition activity is 0.1 ~ 0.2M NaCl concentration and dissolution. The molecular weight of the active component is 32kDa. The 32kDa factor is susceptible to heat treatment and degradation enzyme treatment. These qualitative factors provide a quantity-dependent inhibition of B-cell derived cells (BALL-1), T-cell derived cells (Jurkat) and U937 derived cells. The expression of IL-1 and IL-2 in Jurkat cells was inhibited by P. loescheii and IL-1 secretion in Jurkat cells was inhibited by P. loescheii. P. loescheii DNA isolation, E.coli DNA isolation P. loescheii's immunosuppressive factor gene sequence is a factor in the quality of antisera and in the determination of their immune response. In the process of purification, the factors of P. loescheii culture medium contain Bactopeptone, Yeast extracts and their origins. It's impossible for us to be able to do this. Methods: The method of PCR was carried out by P. loescheii, Cytolysin, etc., and the method of PCR was used to prepare the gene sequence of the reported gene.

项目成果

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