藍色細菌の生物発光リズム:生物時計突然変異遺伝子のクローニングとその機能解析

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平成7年度の研究により以下の成果を得ることが出来た。1 生物時計突然変異遺伝子のクローニング野性型藍色細菌のゲノムDNAバンクを作製し、これを突然変異体(多くの場合劣性変異)に大腸菌との接合を利用して遺伝子移入した。この中から表現形が野性型に戻ったトランスフォーマントを冷却CCDカメラによりスクリーニングし、その遺伝子を大腸菌に回収し、再度突然変異体に導入して相補活性があること確認した。この遺伝子の塩基配列を決定し、蛋白質のアミノ酸配列を確定した。その結果3つの遺伝子からなるオペロンが生物時計の中核をなす機能をもっていることが同定された。2 多くの生物時計突然変異遺伝子のクローニング得られたオペロンを遺他の突然変異体に移入し、形質の復元を調査した。その結果多くの突然変異の形質が復元し、同一の遺伝子座の異なった表現形であることが判明したので、その配列を決定し20個に及ぶ変異部位を確定した。変異は多様でクローニングした遺伝子が時計遺伝子であることが確定した。またいくつかの変異体は独立した変異をもっていることも確認された。これらは今後1の過程を繰り返し、出来るだけ多数の遺伝子のクローニングを試みる。3 この配列のホモロジーをデータベースで検索したが、類似の蛋白質が見つからず、新しい遺伝子であることがわかった。またルシフェラーゼを利用してmRNAレベルの日周変動を調べ、この遺伝子の発現もリズムを示すことを確認した。。4さらに得られた遺伝子の機能ドメインをプローブにして類似遺伝子の存在を多くの生物のゲノムDNAから探索した結果、数種類の藍植細菌には類似の遺伝子が存在することが判明した。