藍色細菌の生物発光リズム:生物時計突然変異遺伝子のクローニングとその機能解析

蓝藻生物发光节律：生物钟突变基因的克隆及其功能分析

• 批准号: 07670097
• 负责人: 近藤 孝男
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670097/
• 关键词: 生物時計; 概日性リズム; シアノバクテリア; 生物発光; 遺伝子発現

平成7年度の研究により以下の成果を得ることが出来た。1 生物時計突然変異遺伝子のクローニング野性型藍色細菌のゲノムDNAバンクを作製し、これを突然変異体(多くの場合劣性変異)に大腸菌との接合を利用して遺伝子移入した。この中から表現形が野性型に戻ったトランスフォーマントを冷却CCDカメラによりスクリーニングし、その遺伝子を大腸菌に回収し、再度突然変異体に導入して相補活性があること確認した。この遺伝子の塩基配列を決定し、蛋白質のアミノ酸配列を確定した。その結果3つの遺伝子からなるオペロンが生物時計の中核をなす機能をもっていることが同定された。2 多くの生物時計突然変異遺伝子のクローニング得られたオペロンを遺他の突然変異体に移入し、形質の復元を調査した。その結果多くの突然変異の形質が復元し、同一の遺伝子座の異なった表現形であることが判明したので、その配列を決定し20個に及ぶ変異部位を確定した。変異は多様でクローニングした遺伝子が時計遺伝子であることが確定した。またいくつかの変異体は独立した変異をもっていることも確認された。これらは今後1の過程を繰り返し、出来るだけ多数の遺伝子のクローニングを試みる。3 この配列のホモロジーをデータベースで検索したが、類似の蛋白質が見つからず、新しい遺伝子であることがわかった。またルシフェラーゼを利用してmRNAレベルの日周変動を調べ、この遺伝子の発現もリズムを示すことを確認した。。4さらに得られた遺伝子の機能ドメインをプローブにして類似遺伝子の存在を多くの生物のゲノムDNAから探索した結果、数種類の藍植細菌には類似の遺伝子が存在することが判明した。

1995年的研究使我们得以实现以下结果：1个生物钟突变基因的克隆基因基因组DNA野生型蓝细菌的基因组DNA库，并使用突变体的基因引入（通常是隐性突变）与大肠杆菌共轭。由此，使用冷却的CCD摄像头筛选了其表型恢复其野生型的转化剂，并将基因收集到大肠杆菌中，并再次引入突变体以确认其具有互补的活性。确定该基因的碱基序列，并确定蛋白质的氨基酸序列。结果，可以确定由三个基因组成的操纵子具有核心生物钟的功能。 2克隆许多生物钟突变基因所获得的操纵子被转移到其他突变体中，并研究了性状的恢复。结果，在同一基因座上恢复了许多突变性状并显示为不同的表型，因此确定了序列并确定20个突变位点。突变是多种多样的，可以证实克隆的基因是时钟基因。也证实了一些突变体具有独立的突变。这些将来会重复一个过程，并尝试克隆尽可能多的基因。 3发现了对该序列的同源性的数据库搜索，但没有发现类似的蛋白质，发现它是一个新基因。我们还使用荧光素酶研究mRNA水平的昼夜变异，并证实该基因的表达也表现出节奏。 。 4此外，使用获得的基因的功能结构域作为探针，从许多生物的基因组DNA中搜索了相似基因的存在，并且发现在几种类型的氰基细菌中存在相似的基因。

项目成果

Liu,Y.et al.: "Bacterial luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria" J.Bacteriol.177. 2080-2086 (1995)

Liu,Y.等人：“细菌荧光素酶作为蓝藻昼夜节律基因表达的报告者”J.Bacteriol.177。

Aoki,S.et al:"Circadian rhythm of dnaK gene expression in cyanobacteria Synechocystis sp.PCC 6803." J.Bacteriol.,. 177. 5606-5611 (1995)

Aoki,S.et al：“蓝藻集胞藻 PCC 6803 中 dnaK 基因表达的昼夜节律。”

Liu,Y.et al.:"Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria,." Genes and Development.9. 1469-1478 (1995)

Liu，Y.et al.：“蓝藻基因表达的昼夜节律编排，”。

Tsinoremas,N.F et.al.: "A sigma factor that modifies the circadian expression of a subset of genes in cvanobacteria." EMBOJ.(印刷中). (1996)

Tsinoremas, N.F 等人：“一种调节 EMBOJ 基因子集昼夜节律表达的因子”（正在出版）。

Johnson,C.H.et.al.: "Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants." Scinece. 269. 1883-1887 (1995)

Johnson,C.H.等人：“植物中细胞质和叶绿体游离钙的昼夜节律波动。”