生物時計の分子機構解明のための新しい実験系の確立

建立新实验体系阐明生物钟分子机制

• 批准号: 04807006
• 负责人: 近藤 孝男
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04807006/
• 关键词: 生物時計; 概日性リズム; らん藻; 生物発光; 遺伝子発現; 形質転換

我々は新しい生物時計の分子機構の解明の可能な新しい実験系を開発することを計画し、以下の試みを行なった。幸いにも我々はらん藻を使って、これらの条件をほぼ完全に満たす実験系の開発に成功した。レポータ遺伝子として利用されている生物発光遺伝子(ルシフェラーゼ)を移入し「人工の時計の針」として機能させることを試み、原核生物で生物発光のリズムを得ることに成功した。我々は多くのらん藻の中から遺伝子導入の容易なシネココッカス7942を選んだ。この単細胞らん藻は外来遺伝子を相同的組み換えによってゲノムに組み込んでしまう。光合成に最も重要であるD1蛋白質の遺伝子のプロモーター下流に、バクテリアの生物発光遺伝子ルシフェラーゼ遺伝子を繋ぎ、このバクテリアに組み込んだ。これに基質でを投与し、生物発光を連続的に測定する装置を開発しその発光を調査したところ、連続明下で2週間以上持続するリズムを得ることが出来た。生物発光は生物時計の測定には理想的であり、また使用したらん藻は単純な原核生物で遺伝子移入や相同的組み換えも容易なので、生物時計の分子機構解明に非常に有利な実験系となる。つぎに概日性リズムであることを確認するために光による位相変位機能、周期の温度不依存性を調べたところ、高等動植物の概日性リズムと全く同様の性質を原核生物においても確認することが出来た。これはらん藻の生物時計の解析によってヒトをも含む多くの生物の時計機構に有効な知見を得られることを期待させるものである。さらに高感度ビテオカメラを利用し、寒天培地上のらん藻のコロニーの発光を3-4時間間隔で120時間にわたって連続観察したところ、寒天培地上の各コロニーから液体培養と同様なリズムを得ることに成功した。これによって生物時計研究者の長年の夢であった「コロニーでの生物時計」を実現し、栄養要求性の解析と同じ効率で生物時計の遺伝子の研究を可能とした。現在コロニーでの生物発光の自動化を進めており、これに成功すれば、莫大な時間と労力を要する生物時計の突然変異体の分離、遺伝子組み換え体の検定などの多数のクローンから目的のものを選別することが現実的なものとなる。なお我々が開発したこの実験系は世界初のものであり、これまでの生物時計現象の理解に基づいてこれを利用すれば、生物時計解明への最短距離に立てることを確信している。この点はこの5月に生物リズムに関する国際集会(フロリダ)で発表したときにも高い評価を得ることが出来た。

我们计划开发一种新的实验系统，该系统可以阐明新生物钟的分子机制，并进行了以下尝试：幸运的是，我们成功地使用了使用藻类开发了一种实验系统，该系统几乎完全满足了这些条件。将其用作报告基因的生物发光基因（荧光素酶）转移到生物发光基因（荧光素酶）中，并且患者能够充当“人造时钟手”，并且患者能够在原始prokaryotes中获得生物发光节奏。我们选择了7942的Cineccus，这很容易从许多藻类中转基因。该单细胞藻类通过同源重组将外藻纳入基因组中。细菌生物发光基因荧光素酶基因与D1蛋白基因启动子的下游相连，该基因对光合作用最为重要，并掺入该细菌中。当对该产品施用底物时，开发了一种连续测量生物发光并研究发光的装置，并在连续光中获得了持续了两周以上的节奏。生物发光是测量生物钟的理想选择，并且由于所使用的藻类是简单的原核和易于引入和同源重组的，因此这是一个实验系统，对于阐明生物时钟的分子机制非常有利。接下来，为了确认它是昼夜节律，我们研究了由光和循环的温度独立性引起的相位位移的功能，并发现较高植物和植物中昼夜节律的性质与原核植物中的特性完全相同。这使我们希望通过分析藻类的生物钟，有效的知识将在包括人类在内的许多生物体的时钟机制中获得。此外，使用高度敏感的Viteo摄像机，在3-4小时的间隔内连续观察到琼脂培养基上藻类菌落的发光120小时，并且结果成功地获得了与琼脂培养基上每个菌落的液体培养物相同的节奏。这使得能够实现期待已久的生物钟研究人员的梦想，“殖民地中的生物钟”，并以与营养营养分析相同的效率研究生物钟基因。目前，菌落中的生物发光正在自动化，如果成功的话，可以从大量克隆中选择所需的产品，包括生物钟中突变体的令人难以置信的耗时且费力的分离，以及经过基因工程的测定法。此外，我们开发的这个实验系统是世界上第一个实验系统，并且我们有信心，如果我们根据对生物时钟现象的理解来使用它，直到现在，我们可以达到阐明生物时钟的最短距离。今年5月在佛罗里达州的国际生物节奏会议上提出了这一点，这一点也受到了高度赞扬。

项目成果

Takao Kondo: "Circadian rhythms in prokaryotes:luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria" Proc.Natl.Acad.Sci.

Takao Kondo：“原核生物的昼夜节律：荧光素酶作为蓝藻昼夜节律基因表达的报告者”Proc.Natl.Acad.Sci。