ピルビン酸キナーゼ異常症モデルマウスにおける遺伝性溶血性貧血の発症機構解明

丙酮酸激酶紊乱模型小鼠遗传性溶血性贫血发病机制的阐明

• 批准号: 07670182
• 负责人: 菅野 仁
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Okinaka Memorial Institute for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670182/
• 关键词: 赤血球; 代謝異常; 疾患モデル

CBAマウス純系コロニー内に自然発症した遺伝性溶血性貧血症の原因を明らかにするため、赤血球酵素活性および解糖中間体の測定、赤血球・肝臓抽出液のイムノブロット解析、肝臓抽出液のアイソザイム解析を行った。赤血球酵素活性の検索では溶血性貧血マウスの赤血球PK活性は正常の3%以下に低下し、PKより上位の解糖系中間代謝産物の蓄積を認めたためこの貧血がPK異常症によることが明らかになった。肝(L)型PKに対するポリクローナル抗体を用いたイムノブロット解析では、赤血球・肝臓内のPKサブユニットの量および分子量に変異マウスと正常対照との差は認めなかったが、変異マウス肝臓抽出液の活性染色では本来認められるL型アイソザイム活性は認められず、正常肝ではごく低い発現を認めるM2型PK活性のみが検出された。このことから変異マウス赤血球および肝のPK蛋白量はほとんど正常だが、その活性はほぼ完全に消失していることが明らかになった。RACE法にてCBA系マウス骨髄mRNAからマウス赤血球(R)型PKcDNAクローニングを行い、得られた配列をもとに異常マウスの分子異常を決定した。マウスR型PKcDNAは574アミノ酸をコードし、翻訳領域におけるヒトR型PKとの相同性は塩基レベルで86.1%、アミノ酸レベルで91.5%であった。PK異常マウスのR型PKcDNAの塩基配列を解析したところ、単一塩基置換1013GGT→GATのホモ接合体であることが明らかになった。この変異によりR型PKの活性中心を構成する338番目のGlyがAspに置換する。337番目のArg残基を中心にした5つのアミノ酸はPK遺伝子のエクソン8にコードされ、基質ホスホエノールプルビン酸との結合に重要であり、この変異により活性中心の構造変化が引き起こされ、基質親和性が低下して赤血球内の生理的基質濃度におけるPK活性がほとんど消失したものと結論できた。ヒトPK異常症においても同様の活性中心変異が同定されており、その赤血球PKの解析で本来成熟赤血球には残存しないM2型PKが検出されている。同様の重篤な構造変異でありながら本マウスのPK異常症がヒトのPK異常症より貧血の重症度が軽いのは、主として脾臓において対照の約66倍もの著明な赤芽球産生の亢進が存在することによると考えられる。このPK異常症マウスはヒトPK異常症の病態解析および新しい治療法開発に極めて有用と考えられる。

CBA is a natural disease in the human body. The causes of hereditary hemolytic anemia are discussed. The enzyme activity of erythrocytes and the determination of glucose-hydrolysis intermediates are discussed. The enzyme analysis of erythrocytes and liver extracts is carried out. Hemolytic anemia, hemolytic anemia Liver (L)-type PK antibody analysis, erythrocytes, liver PK protein content, molecular weight, and normal contrast, liver extract activity staining, L-type PK protein activity, and normal liver activity. At this time, the amount of PK protein in red blood cells and liver has changed from normal to normal, and the activity has completely disappeared. RACE method is used to determine the molecular abnormality of erythroid (R)-type PKD. R-type PK cDNA 574 has the identity of 86.1% and 91.5% respectively. PK abnormality analysis of R-type PKcDNA base alignment: GGT→GAT The active center of R-type PK is composed of 338 amino acids and Gly and Asp. Arg residues in the center of 337 amino acids are important for PK gene synthesis, matrix formation, and binding of these amino acids. The structural changes in the active center lead to low matrix affinity and physiological matrix concentrations in erythrocytes. PK abnormalities in red blood cells are characterized by changes in the activity centers of the same type, and by the presence of M2-type PK in mature red blood cells The severity of anemia is about 66 times higher than that of normal PK disorders. PK abnormality is a disease that can be resolved by new treatment methods.

项目成果

M. Morimoto, H. Kanno et al.: "Pyruvate kinase deficiency of mice associated with nonspherocytic hemolytic anemia and cure of the anemia by marrow transplantation without host irradiation" BLOOD. 86. 4323-4330 (1995)

M. Morimoto、H. Kanno 等人：“与非球形细胞溶血性贫血相关的小鼠丙酮酸激酶缺乏症以及通过骨髓移植无需宿主辐射来治愈贫血”BLOOD。

Hitoshi Kanno, et al.: "Primary structure of murine red blood cell-type pyruvate kinase(PK)and molecular characterization of PK deficiency identified in the CBA strain" BLOOD. 86. 3205-3210 (1995)

Hitoshi Kanno 等人：“鼠红细胞型丙酮酸激酶 (PK) 的一级结构和 CBA 菌株中鉴定的 PK 缺陷的分子特征”BLOOD。