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強い結合力を持つヒトモノクローナル抗HCMV中和抗体のファージ発現系による作製

利用噬菌体表达系统生产具有强结合力的人单克隆抗HCMV中和抗体

基本信息

批准号：
07670350
负责人：
井原征治
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

骨髄移植などの臓器移植医療では潜在ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の再活性化、つまりHCMV感染症が大きな問題となっている。これを予防する目的で、免疫グロブリン製剤が使用されるがその効果は万全とは言えない。そこでより有効な免疫グロブリン製剤を作製する目的で、抗HCMV中和抗体価が高いヒトのB細胞から抗体遺伝子をクローニングし、ヒトモノクローナル抗体を作製する技術に取り組み、いくつかの点で進歩があった。(1)末梢血B細胞よりmRNAを抽出し、RT-PCRで抗体のL鎖およびH鎖を増幅し、pRPLS/Fablベクターにクローニングして、大腸菌に導入した。この実験の過程で、H鎖は大腸菌に毒性を示すことが判明した。そこで、H鎖に耐性を示す株の発見につとめ、DH21株が目的にかなうものであることを見出した。その後発現実験を行い、SDS-PAGEやWestern Blotで解析した結果、両鎖ともに発現していることが確認できた。(2)HCMVを構成する蛋白質のうち、中和エピトープを持つ蛋白質は3種知られている。そのうちgB蛋白質に対する抗体(抗gB抗体)が最も強力な中和活性を示す。抗gB抗体を特異的に分離する為には、gB抗原の調整が必用である。抗原の調整はいくつかの方法があるが、ここでは組み換えgB蛋白質の調整をめざした。gB蛋白質は分子内に2ヶ所の中和エピトープを持つため、これらの領域をPCRで切り出し、発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは4種を試用したが、MBPと融合して発現させる方式のpMALベクターが最も有効であり、2つのエピトープ部分とも発現することに成功した。両エピトープは精製し、パニングに使用する体制は整った。(3)上記の過程を経て、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーを作製し、抗HCMV中和抗体をスクリーニングした結果、中和活性を持ついくつかのクローンが分離できた。今後は、より高いKd値をもつクローンの分離をめざす。

Bone transplantation and organ transplantation medicine are potential problems for reactivation of HCMV infection. For this purpose, the immune system is used to prevent and treat diseases. For this purpose, anti-HCMV neutralizing antibodies are used to produce high levels of B cell antibody gene. (1)Peripheral blood B cell mRNA extraction, RT-PCR, antibody L-lock and H-lock amplification, pRPLS/Fabl detection, Escherichia coli introduction The process of infection and the identification of E. coli toxicity DH21 is a plant with a high tolerance for viruses. The results of SDS-PAGE and Western Blot analysis were confirmed. (2)HCMV constitutes three kinds of proteins: protein, neutral protein and protein. Antibodies against the gB protein (anti-gB antibodies) showed the most potent neutralizing activity. Anti-gB antibodies are specific for isolation, and adjustment of gB antigens is necessary. Antigen regulation is a method to regulate protein. The gB protein holds the key to neutralization in two parts of the molecule, and this field is cut out by PCR, revealing the discovery of the event. 4 kinds of trial, MBP and fusion methods were successfully developed. The system is refined and used. (3)The process described above is characterized by the presence of anti-HCMV neutralizing antibodies, the presence of anti-HCMV neutralizing antibodies, and the presence of neutralizing antibodies. From now on, Kd is high.