先天性プラスミノゲン欠乏症の遺伝子異常、発症機構および病態生理に関する研究

先天性纤溶酶原缺乏症的遗传异常、发病机制及病理生理学研究

• 批准号: 07671211
• 负责人: 重清 俊雄
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671211/
• 关键词: プラスミノゲン; 先天性血栓性素因; 先天性プラスミノゲン欠乏症; 遺伝子異常; 発症機構; 病態生理

(1)本研究では、先天性プラスミノゲン(PLG)欠乏症のC家系とN家系の遺伝子異常が明らかになった。polymerase chain reaction(PCR)法を用いて発端者のPLG遺伝子の19個のエクソンを増幅した後、M13ベクターにサブクローニングし、dideoxy法で塩基配列を決定した。その結果、PLG遺伝子のエクソン17にAla^<675>からThrへのアミノ酸置換を生じるコドンGCTからACTへの変異を約半数のクローンに認めた。このGからAへの変異により、この部位に新たにMae III(GTNACを認識する)の制限酵素部位が形成されることを利用して、C家系の各家系員のPCRフラグメントの切断解析を行った。その結果、PLG欠乏症の家系員にのみ、発端者と同様に正常対立遺伝子と変異対立遺伝子とを有するヘテロ接合体の切断パターンを認めた。さらにK家系について同酵素による切断解析を行ったところ、PLG欠乏症の発端者と弟にC家系と同一の切断パターンを認めた。このように、凝血学的検査所見と遺伝子解析の結果が一致したことから、C家系およびK家系のPLG欠乏症はエクソン17における点突然変異が原因であることが明らかにされた。(2)先天性PLG欠乏症のN家系ですでに同定されているSer^<572>→Proへの変異により、PLG欠乏症が引き起こされる機序を遺伝子発現実験で解析した。PLGcDNA内にSer^<572>→Proへの変異を部位特異的変異誘発法で作製し、正常および変異PLGcDNAをpCDM_<neo>哺乳動物発現ベクターに挿入することにより発現プラスミド(pTH3/WT、pTH3/S572P)を構築した。pTH3/WTおよびpTH3/S572PをCOS-1細胞にトランスフェクトし、^<35>S-メチオニンでラベル後、抗PLG抗体を用いて免疫沈降法で検討した。その結果、組み換え正常および変異PLG(rWT、rS572P)はともに培養上清中に検出され、しかもその分子サイズはHepG2細胞から分泌されたそれと同じであった。さらに、培養上清中に分泌されるrS572Pの量はrWTのそれに比べて著しく少ないことも認められた。現在、rS572P分子の分泌不全の機序についてさらに詳細に検討中である。

(1)In this study, congenital deficiency syndrome (PLG) in C and N families was studied. Polymerase chain reaction(PCR) method was used to determine the 19 PLG genes in the middle of the developer, M13 method was used to determine the nucleotide sequence, and dimethoxy method was used to determine the nucleotide sequence. As a result, PLG gene expression was detected by Ala^<675>Thr ^Acid substitution. GCT gene expression was detected by about half of the gene expression. The PCR products of the members of the C family were analyzed for the formation of restriction enzyme sites in the new Mae III(GTNAC) gene. The results show that the family members with PLG deficiency have the ability to identify the normal counterpart and the different counterpart. The same enzyme was detected in the K family, and the same enzyme was detected in the C family. The results of the analysis of PLG deficiency in families C and K were consistent. (2)Analysis of the sequence of gene development in N families with congenital <572>PLG deficiency A <572>site-specific variant of Ser^ →Pro ^in PLG cDNA was constructed from normal to variant PLG cDNA pCDM_<neo>Mammalian discovery sites (pTH3/WT, pTH3/S572P). pTH3/WT pTH3/S572P was detected in COS-1 cells by <35>immunoprecipitation method after transfection and ^S-Menu The results showed that the cell culture supernatant of HepG2 cells was normal and different. The amount of rS572 P secreted in culture supernatant was lower than that in culture supernatant. Now, the mechanism of incomplete secretion of rS572P molecule is discussed in detail.

项目成果

Nobuaki Mima: "A novel missense mutation in two families with congenital plasminogen dificiency : Identification of an Ala^<675> to Thr^<675> substitution" Thrombosis Haemostasis. 71. 96-100 (1996)

Nobuaki Mima：“两个患有先天性纤溶酶原缺陷的家族中的一种新型错义突变：Ala^<675> 到 Thr^<675> 取代的鉴定”血栓止血。