電気細胞融合法による有用遺伝形質獲得に向けた単細胞緑藻の育種開発プログラム

利用电细胞融合方法获得有用遗传性状的单细胞绿藻育种和开发计划

• 批准号: 07805074
• 负责人: 葉山 八千代
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07805074/
• 关键词: 電気的細胞融合; Haematococcus pluvialis; Dunaliella; アスタキサンチン; β-カロテン; プロトプラスト調製; 雑種緑藻

本研究で着目した2種類の単細胞緑藻であるヘマトコッカスとドナリエラには、それぞれ微生物産業で活用するうえで有用な特徴として、前者には高い抗酸化活性をもつケトカロテノイドであるアスタキサンチン生合成能があり、後者には飽和濃度に近い食塩濃度条件下でβ-カロテンを高含量に蓄積する能力がある。特にドナリエラの優れた耐塩性は雑菌の侵入汚染を防ぐことから、屋外開放池で培養できる利点がある。そこで、本研究ではこれらの有用緑藻の優れた特徴を合わせ持つ雑種緑藻を育種するために、従来の化学的融合法に比べて効率がよいとされる電気的細胞融合法に着目し、融合に適する細胞調製の条件等を検討した。平成7年度の研究成果を以下に概述する。融合時には細胞壁を除去する必要があり、ヘマトコッカスについては細胞周期を同調培養法によって調節後にプロテアーゼ処理により90%以上の高い収率でプロトプラスト細胞を調製することができた。一方、ドナリエラについては浸透圧調整条件を調べた結果、50mM程度のリン酸緩衝液に懸濁するだけでも細胞が破裂することから、堅固な細胞壁を持たず、細胞膜の少なくとも一部が外界に露出していることが示唆された。そこで、酵素処理したヘマトコッカスと未処理のドナリエラについて、まず交流電圧を印加して両細胞を数珠つなぎに配向させる条件を検索し、糖アルコール系の緩衝液を使えば、1MHz,150V/cmにより1視野当たりでも3-6個の両細胞がランダムに配列されることが確認できた。次に、直流高電圧の印加条件については、50m秒,2,000V/cmを与えると細胞間の接着面における境界膜の破砕が観察されたので、電気細胞融合によりキメラ雑種緑藻を単離できる可能性が示唆された。これらの結果より、融合候補のスクリーニング系を開発に向けて、親株への選択標識および雑種細胞の選択条件の開発に取り組むことにした。

In this study, two species of single-cell green algae were studied. The former had high anti-acidification activity, while the latter had the ability to accumulate high levels of β-chlorophyllin at saturation concentrations. In particular, it has excellent resistance to bacterial invasion and pollution, and outdoor open pool cultivation. In this study, we discussed the characteristics of the useful green algae, the combination of different species of green algae, the chemical fusion method, the comparison of the efficiency, the electric cell fusion method, the conditions of cell modulation, etc. The research results of Heisei 7 are summarized below. The cell wall must be removed during fusion, and the cell cycle must be regulated by a high recovery rate of more than 90%. The results of adjusting the osmotic pressure conditions, the suspension of 50mM acid buffer, the rupture of cells, the maintenance of solid cell walls, and the partial exposure of cell membranes to the outside world were obtained. For example, the enzyme treatment and untreated conditions for cell alignment were investigated. The buffer solution of the glucose control system was used at 1MHz,150V/cm for 1 field of view. When 3-6 cells were aligned, it was confirmed. Secondly, under the high DC voltage conditions of 50m seconds and 2,000 V/cm, the breakdown of boundary membranes at the interface between cells can be observed, and the possibility of green algae growing independently during electrical cell fusion has been demonstrated. The results of this study include the development of fusion candidate cell lines, the selection of parental cells, and the selection of seed cells.