植物におけるステロール及びトリテルペンの生合成研究

水浸4日後のエンドウの芽生えからRNAを抽出し、逆転写酵素により一本鎖のcDNAを合成した。これを鋳型に、アラビドプシスのサイクロアルテノールサイクラーゼ(CYC)のN末、およびC末のアミノ酸配列に対応する合成オリゴDNA((AT-NcoI、及びAT-BamHI)をプライマーとして用いてPCRを行った。しかしながら、期待する大きさの生成物をアガロース電気泳動で検出することができなかった。次に、アラビドプシスのCYCとカンジダのラノステロール合成酵素において極めて相同性の高い二つのアミノ酸配列KGAWPFST及びYPYVECTに基づくオリゴDNA(467S及び、556A)を合成し、 ″nested″ PCRを行った。一回目のPCR(467S、AT-BamHI)では、アガロース電気泳動上はっきりしたバンドを検出できなかったが、二回目のPCR(467S、556A)において、289bpのバンドを検出することができた。この生成物をプラスミドベクターにサブクローニングし塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで79%、アミノ酸レベルで84%の相同性を示した。次に、この289bpの塩基配列を基に、5′及び3′RACE法により、全長クローンのクローニングを行った。全領域の塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで76%、アミノ酸レベルで80%の相同性を示した。得られた配列をもとにPCRを行い、全長クローンを得た。得られた全長クローンをGAL1プロモータの下流につなぎ、酵母に導入した。ガラクトースで発現を誘導し、酵素活性を調べたところ、CYCの活性を検出することができ、得られたクローンはCYCをコードしている遺伝子であると判断した。

水浸4日後のエンドウの芽生えからRNAを抽出し、逆転写酵素により一本鎖のcDNAを合成した。これを鋳型に、アラビドプシスのサイクロアルテノールサイクラーゼ(CYC)のN末、およびC末のアミノ酸配列に対応する合成オリゴDNA((AT-NcoI、及びAT-BamHI)をプライマーとして用いてPCRを行った。しかしながら、期待する大きさの生成物をアガロース電気泳動で検出することができなかった。次に、アラビドプシスのCYCとカンジダのラノステロール合成酵素において極めて相同性の高い二つのアミノ酸配列KGAWPFST及びYPYVECTに基づくオリゴDNA(467S及び、556A)を合成し、 ″nested″ PCRを行った。一回目のPCR(467S、AT-BamHI)では、アガロース電気泳動上はっきりしたバンドを検出できなかったが、二回目のPCR(467S、556A)において、289bpのバンドを検出することができた。この生成物をプラスミドベクターにサブクローニングし塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで79%、アミノ酸レベルで84%の相同性を示した。次に、この289bpの塩基配列を基に、5′及び3′RACE法により、全長クローンのクローニングを行った。全領域の塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで76%、アミノ酸レベルで80%の相同性を示した。得られた配列をもとにPCRを行い、全長クローンを得た。得られた全長クローンをGAL1プロモータの下流につなぎ、酵母に導入した。ガラクトースで発現を誘導し、酵素活性を調べたところ、CYCの活性を検出することができ、得られたクローンはCYCをコードしている遺伝子であると判断した。