植物におけるステロール及びトリテルペンの生合成研究

植物甾醇和三萜生物合成研究

• 批准号: 07808066
• 负责人: 渋谷 雅明
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07808066/
• 关键词: エンドウ; サイクロアルテノール; サイクラーゼ; cDNA; クローニング; PCR

水浸4日後のエンドウの芽生えからRNAを抽出し、逆転写酵素により一本鎖のcDNAを合成した。これを鋳型に、アラビドプシスのサイクロアルテノールサイクラーゼ(CYC)のN末、およびC末のアミノ酸配列に対応する合成オリゴDNA((AT-NcoI、及びAT-BamHI)をプライマーとして用いてPCRを行った。しかしながら、期待する大きさの生成物をアガロース電気泳動で検出することができなかった。次に、アラビドプシスのCYCとカンジダのラノステロール合成酵素において極めて相同性の高い二つのアミノ酸配列KGAWPFST及びYPYVECTに基づくオリゴDNA(467S及び、556A)を合成し、 ″nested″ PCRを行った。一回目のPCR(467S、AT-BamHI)では、アガロース電気泳動上はっきりしたバンドを検出できなかったが、二回目のPCR(467S、556A)において、289bpのバンドを検出することができた。この生成物をプラスミドベクターにサブクローニングし塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで79%、アミノ酸レベルで84%の相同性を示した。次に、この289bpの塩基配列を基に、5′及び3′RACE法により、全長クローンのクローニングを行った。全領域の塩基配列を決定したところ、アラビドプシスのCYCとDNAレベルで76%、アミノ酸レベルで80%の相同性を示した。得られた配列をもとにPCRを行い、全長クローンを得た。得られた全長クローンをGAL1プロモータの下流につなぎ、酵母に導入した。ガラクトースで発現を誘導し、酵素活性を調べたところ、CYCの活性を検出することができ、得られたクローンはCYCをコードしている遺伝子であると判断した。

After soaking in water for 4 days, the bud was born and the RNA was extracted, and the enzyme was written in reverse and the cDNA was synthesized.これを鋳式に、アラビドプシスのサイクロアルテノールサイクラーゼ(CYC)のN-terminal, およびC-terminated のアミノ acid ligation に対応するsynthetic オリゴDNA ((AT-NcoI, and びAT-BamHI) をプライマーとして was generated using いてPCR を行った. しかしながら, look forward to する大きさの物をアガロース电気 Swimmingで検出することができなかった. Time, アラビドプシスのCYCとカンジダのラノステロールsynthetic enzyme においいて极めてidentityの高い二つのアミThe acid combination KGAWPFST and YPYVECT にづくオリゴDNA (467S and び, 556A) are synthesized. "nested" PCR is OK. 1st round of PCR (467S, AT-BamHI)なかったが, second round PCR (467S, 556A) において, 289bp のバンドを検出することができた.このproduct をプラスミドベクターにサブクローニングし塩base arrangement をdetermination したところ、アラThe identity of ビドプシスのCYC and DNA レベルで is 79%, and the アミノ acid レベルで84% is shown. Second, the 289bp base alignment method, the 5′ and the 3′ RACE methodより, full length クローンのクローニングを行った. All fields of base allocation are determined by したところ、アラビドプシスのCYCとD NA レベルで 76%, Amin acid レベルで 80% sameness is shown. The られた arrangement is the をもとにPCRを行い, and the full-length クローンを德た. Got The full length of られたクローンをGAL1プロモータの流につなぎ、Yeastに Importした.ガラクトースで発appears to induce し, enzyme activity を adjusts べたところ, CYC activity を検出することができ、得られたクローンはCYCをコードしている缝子であるとJudgmentした.

项目成果

Osamu Nakajima: "cCNA and Genornic DNA Cloning of Chalcone Synthase from Pueraria lobata" Biol.Pharm.Bull.19. 71-76 (1996)

Osamu Nakajima：“来自葛根的查尔酮合酶的 cCNA 和基因组 DNA 克隆”Biol.Pharm.Bull.19。

Masayuki Kusano: "Molecular Cloning of cDNA encoding Rat.2,3-Oxidosqualene:Lanosterol Cyclase" Biol.Pharm.Bull.18. 195-197 (1995)

Masayuki Kusano：“编码 Rat.2,3-Oxidosqualene:Lanosterol Cyclase 的 cDNA 的分子克隆”Biol.Pharm.Bull.18。

Chung Ki Sung: "Molecular Cloning of cDNA encoding Human Lanosterol Syothase" Biol.Pharm.Bull.18. 1459-1461 (1995)

Chung Ki Sung：“编码人羊毛甾醇交酶的 cDNA 的分子克隆”Biol.Pharm.Bull.18。