アドレノメデュリン(AM)受容体の役割の解明および新規AM受容体の探索

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1.AM受容体の機能を特異的に抑制する手段の確立(主として江藤胤尚と桑迫健二が行う):(1)AMの受容体結合を抑制する遺伝子の探索:我々は、AM受容体の修飾蛋白である3つのRANP1,-2,-3にはAMの結合部位はなく、これらがbinding pocketの形成に不可欠であることを明らかにしてきた。AMの結合部位はその受容体の構成蛋白であるCRLRに存在していると考え、この責任領域を特定すべく、CRLRとVIP2受容体(ともにClassBのG蛋白共役型受容体に属すが、RAMPはVIP2受容体に作用できない)のキメラ蛋白(9種)を独自に作製した。これらのキメラ蛋白のN末端にV5タグを付加して、各RAMPとの共発現後の細胞膜発現をFACS解析により定量化した。さらに、^<125>I-AMの結合性やAMによるcAMP反応性を検討することにより、AMの結合に重要なCRLRの領域を大まかに同定することが出来た。今後、その領域を標的に種々の変異体(キメラ蛋白/欠失体/1塩基置換体)を順次作製して、最終的に責任領域を同定したい。(2)AM結合に重要なRAMP領域を認識する抗体の作製:上記(1)の検討から、AMはCRLRの細胞外のN端領域と第1ループに結合していると考えられるため、その領域をHEK-293細胞に過剰発現させたものを抗原としてポリクローナル抗体の作製を試みているところであり、まだ最終結果は得られていない。(3)AM受容体の蛋白合成を阻害するアンチセンスとsiRNAの作製:これらに関しても、現在検討中である。2.新規AM受容体の探索(主として北村和雄が行う):上記1の手段をすべて確立した後に、本研究を行う予定である。