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細胞外EGF様反復構造を有する7回膜貫通型ヒト受容体EMR1に関する研究:抗体作成と発現細胞の同定、結合分子とシグナルの検討、並びにリガンドの探索

EMR1（一种具有细胞外EGF样重复结构的七次跨膜人类受体）的研究：抗体产生和表达细胞的鉴定、结合分子和信号的研究以及配体的搜索

基本信息

批准号：
14657250
负责人：
湯尾明
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Research Institute, International Medical Center of Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657250/
关键词：
7回膜貫通型受容体 EMR1 単球 G蛋白共役受容体モノクローナル抗体

项目摘要

細胞外EGF様反復構造を有する7回膜貫通型ヒト受容体EMR1は、一般的な化学性走化因子の受容体とは異なる特異な構造を有する。本研究においては、この受容体に対するモノクローナル抗体を作成し、ヒト血球における発現分布を明らかにする。また、リガンド分子もしくは抗受容体抗体を用いて、会合分子の存在やシグナル伝達機構を探求する事を目指した。昨年より継続して可溶性組換えヒトEMR1分子の構築及び発現を検討してきた。これは免疫原として使用する為、及び直接細胞へ作用させて細胞膜表面上のリガンド分子の解析に用いる為の二点の理由からである。ヒト免疫グロブリン遺伝子と融合させた発現カセットを構築するにあたり、近年その存在が知られる様になったGPSドメインが未知の蛋白分解酵素の攻撃を受け、その結果生成した融合蛋白質が分解される事が判明した為、その部位を除去した可溶性組換えヒトEMR1発現カセットを構築し、アフリカミドリザル由来のCOS1及びCOS7細胞へ導入したが、遺伝子が導入され蛋白質を発現している細胞は容易に速やかな細胞死を起こし、一過性発現で組み替え蛋白質を十分量得ることは困難であった。そこでCOS細胞以外での蛋白産生系を検討し、可溶性蛋白質産生に適した細胞としてハムスター由来のCHO細胞及びBalb/cマウス由来のBalb/3T3細胞を選択した。Balb/3T3細胞については、SV40ウイルス断片を含む当該発現ベクターとの組み合わせを考慮して予めSV40ゲノムにて形質転換させ、SV40LargeT抗原を高発現する細胞をも樹立した。この細胞へ導入したSV40複製起点を含むプラスミドはCOS細胞と同等以上の複製効率を示した。これらの細胞を用い、更に蛋白質発現ベクターとしてヒトEF-1alphaプロモーターを用いた発現系を併せて使用することで融合蛋白質の産生性を改善する事が出来た。

The extracellular EGF repeats the structure of seven membrane-penetrating receptors EMR1, and the receptor of a general chemical transfer factor differs from the structure of seven membrane-penetrating receptors EMR2. In this study, the receptor antibody was prepared and the distribution of the receptor antibody was clarified. The use of anti-receptor antibodies, the existence of fusion molecules, and the search for receptor mechanisms are also discussed. The molecular structure and development of soluble EMR1 were discussed in this paper. There are two reasons why immunogens are used in isolation, and for direct cellular interaction, and for the resolution of molecules on cell membranes. In recent years, the existence of fusion proteins has been known, such as GPS and EMR, which are attacked by unknown proteolytic enzymes, and the production of fusion proteins. COS1 and COS7 cells were introduced into the cells, and protein was introduced into the cells. The cells were easy to produce protein, and the cells were easy to produce protein. The protein production system in addition to COS cells was investigated, and the soluble protein production system was selected from CHO cells and Balb/3T3 cells. Balb/3T3 cells contain SV40 large-antigen fragments. When the expression of SV40 large-antigen fragments is considered, SV40 large-antigen cells are established. The replication efficiency of SV40 cells introduced into COS cells was demonstrated by the replication origin of SV40 cells. The use of fusion proteins in the production of EF-1alpha fusion proteins and the use of fusion proteins in the production of EF-1alpha fusion proteins