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霊長類ES細胞からの無フィーダー、無血清培養における血液細胞分化システムの確立

灵长类ES细胞无饲养层无血清培养血细胞分化体系的建立

基本信息

批准号：
16659260
负责人：
湯尾明
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Research Institute, International Medical Center of Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ES細胞からの血球分化誘導においては、分化誘導効率の悪さ、2次造血の困難、骨髄系の分化の困難、等の諸問題が存在する。これらの諸問題は、従来頻繁に用いられていたフィーダー細胞であるOP9細胞の限界を示すものと考えられる。以上のような諸問題を克服するために、骨髄球系への分化誘導に優れていると報告されたフィーダー細胞10T1/2を用いて研究を行った。まず、サイトカイン、増殖因子の存在下で、浮遊細胞を長期間培養し、球状の血球と思われる細胞の出現を観察し、少数のCD34陽性細胞が認められた。しかし、この方法では、その後、次第に死細胞が多くを占めるに至り、十分な分化細胞は得られなかった。次に、10T 1/2細胞との共培養ではあるが、浮遊細胞ではなく接着細胞を継代して分化誘導を行ったところ、培養開始2週間目においてシート状コロニー(敷石状細胞からなる平たい円形のコロニー)が多数認められ、その中には球状細胞の集塊が載っている部分も多く認められた。この様な時期の細胞を回収して生細胞のCD34抗原発現量をFACSで定量したところ25%程度の陽性細胞が認められた。さらに、胚様体を3日間形成させた後に10T 1/2細胞との共培養を行い、前期と同様に生細胞のFACS解析を行ったところ、30%とさらに高率のCD34陽性細胞が認められ、しかも、CD34発現の非常に高い分画が認められた。無フィーダー分化培養の新しい試みとして、conditioned dishを作成して用いた。具体的には、胚様体を3日間形成後、C3H 10T 1/2細胞を培養したdishをグルタールアルデヒドで固定して、そこでES細胞の分化誘導を行った。この方法においても、敷石状の細胞が観察され、CD34陽性細胞が出現した。

Problems such as ES cell ら, <s:1> blood cell differentiation induction におてて, differentiation induction efficiency <e:1> 悪さ, difficulty in secondary hematopoiesis, difficulty in bone marrow system differentiation, etc. exist がする. は, 従これらの these issues to frequent にいられていたフィーダー cells である OP9 cells の limit を shown すものと exam えられる. Above のようをな these issues to overcome するために, bone marrow and ball への induction に optimal れていると report されたフィーダー cells 10 t1/2 をいを line って research た. まず, サイトカイン, raised で, phytoplankton cells in the presence of colonization factor のを between long-term cultivation し, globular の blood と think われる cells appear のを観し, minority のが CD34 positive cells to recognize められた. しかし, この way では, その after, and sizable に dead cells がくを of めるに to り, very な differentiated cells はられなかった. Youdaoplaceholder0, 10T 1/2 cells との trained ではあるが, phytoplankton cells ではなく then cells を継 generation し induced を line って differentiation たところ, cultivation began two weeks between mesh においてシート shape コロニー (apply the stone cell からなる flat たい has drifted back towards ¥ form のコロニー) が most recognize められ, その in には spherical cell の agglomerate が load っている partly もく recognize めら Youdaoplaceholder0. この others な period の cells を back 収して living cells の CD34 antigen を発 now quantity both FACS で quantitative したところ 25% degree がの positive cells to recognize められた. さらにを 3 day and others in embryo, body formation させたに after 10 t 1/2 cells との trained early とをい, with others in に living cells の both FACS parsing line をったところ, 30% とさらに high rate のが CD34 positive cells to recognize められ, しかも, CD34 発 is のにい points draw が very high recognition められた. There is no フィダダ <e:1> differentiation culture of <s:1> new <s:1> try みとてて and conditioned dishを to make <s:1> て use フィた. Specific には and others body を 3 day, after the formation of embryo, C3H 10 t 1/2 cell を culture した dish をグルタールアルデヒドで fixed して, そこでの ES cell differentiation induced を line った. The <s:1> <s:1> method におにおてててにお, the stellate <s:1> cells が観 were examined され, and the CD34-positive cells が showed <s:1> た.