新に確立したDLAクラスII遺伝子ホモ接合体の犬による移植免疫寛容誘導研究の評価

新建立的DLA II类基因纯合犬移植免疫耐受诱导研究的评价

• 批准号: 14657290
• 负责人: 渡部 浩二
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657290/
• 关键词: DLA-DRB1; Homozygotes; PCR-SSCP; direct sequencing; PCR product typing; MLR; lymphocytocytotoricixity

DLA-DRB1 homozygous犬はbeagleと家系の3代目で2系統、aa系(雄1、雌3)、dd系(雄2、雌1)(祖父ab、祖母cd)、mongral犬で1系統、ee系(雄1、雌1)(H15年3月)。この中beagle犬の4代目でlinestに成功した(H15.2月7日生、dd-type、雄2、雌2)、mongral犬では3代目で1系統ee系(祖父ef、祖母gh)で交配待機中。手法はPCR-SSCP法、リンパ球混合培養法、第一代祖父・母・間交互免疫した抗血清によるリンパ球障害試験、direct sequencing法により確認している。今年度は、direct sequencingの塩基配列をもとにすでに公表されているDLA-DRB1のsequenceのDRB1,00101〜03001の各々と比較検討し、上記命名した遺伝子型a-type,00101,b-type,01501/02,c-type,00102,d-type,01901の塩基配列の相違をもとにして、typing primerを20merのForward Primer 4種、Reverse Primer 1種を設計して用い、PCR reaction productの調整、Agarose gelによる電気泳動を行ない比較したところ、上記homozygotes dd-typeとaa-typeは明確に表示区別することができた。したがって今後、本家系のdd-typeとaa-typeのhomozygotesは本実験系のDNA-PCR productsを上記primerを用いてPCR増幅し、電気泳動すれはhomozygotesを同定することが可能となった。また上記抗血清によるcytotocicity testによる結果はPCR・SSCPの結果と一致したが、さらに各免疫個体の血小板で吸収した上清および血小板に附着したクラスI抗体を溶出した抗体を用い、クラスI、クラスIIのtypingが可能になった。今回作出したhomozygotesは、クラスI、クラスIIが一致したものと判定した。現在、免疫沈降法によってクラスI抗体を明確にすることが出来た。今後、交配および維持は、犬の繁殖施設に譲渡する計画を進めている。本beagle家系の4代目のhomozygousのlineは、雄2、雌2であり、line化の自途はついている。尚今回の研究ではhomozygotesの作出法とその同定法を確立したが、この成果は、本年9月欧州移植学会で発表の予定である。さらに本件のhomozygotesの作製法については、特許申請を準備中である。Homozygotesを用いた移植実験は現在、皮膚移植実験を移行中であり、今後、予定しているhomozygotesを用いた移植実験の対照となる。

In the third generation of DLA-DRB1 homozygous dogs, beagle pedigree: eye 2 system, aa line (male 1, female 3), dd line (male 2, female 1) (grandfather ab, grandmother cd), mongral dog system 1, ee line (male 1, female 1) (H15 March). The fourth generation of beagle dogs (H15.February 7, dd-type, male 2, female 2) and the third generation of mongral dogs were successfully mated in the ee system (grandfather ef, grandmother gh). Manual PCR-SSCP method, mixed culture method, antiserum of the first generation of mutual immunity between grandparents, and direct sequencing method were used to confirm the infection of the ball. This year, direct sequencing and direct sequencing have been assigned to the following list: public table, DLA-DRB1, sequence, DRB1,00101~03001, each and every one of them, and the name of the above is the name of the sub-type, the type of type, the type. 01901 yuan is equipped with four kinds of equipment, such as typing primer 20mer Forward Primer, Reverse Primer 1 equipment design equipment, PCR reaction product equipment, Agarose gel electrophoretic swimming equipment, and the above homozygotes dd-type aa-type clearly indicates the difference between each other. In the future, our family dd-type

项目成果

渡部浩二: "犬の皮膚移植"Organ Biology. 9(4). 397-405 (2002)

渡边浩二：“狗皮肤移植”器官生物学9（4）397-405（2002）。

渡部浩二他: "PCR・SSCP法によるDLA-DRB1型homozygous犬の確立"日本移植学会雑誌. 37. 345 (2002)

Koji Watanabe 等人：“通过 PCR/SSCP 方法建立 DLA-DRB1 型纯合狗”日本移植学会杂志 37. 345 (2002)。

渡部浩二: "臓器移植の現状と検査"臨床病理(レビュー特集). 124. 21-31 (2003)

Koji Watanabe：“器官移植的现状和检查”临床病理学（评论专题）124. 21-31（2003）。

Koji Watanabe et al.: "Successful production of DLA-DRB1 homozygous line in the beagle dogs"11th Congress of the European Society for Organ Transplantation. (発表予定). (2003)

Koji Watanabe 等人：“在比格犬中成功生产 DLA-DRB1 纯合系”，欧洲器官移植学会第 11 届大会（即将提交）。