インテグリン発現に基づいた消化管Stem Cells同定・分離のための基盤的研究

基于整合素表达的胃肠道干细胞鉴定与分离基础研究

• 批准号: 14657307
• 负责人: 藤本 康二
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657307/
• 关键词: 大腸; Stem cells; β1インテグリン; Crypt; Soft agar

大腸Stem cellsのマーカー分子を同定するため、細胞外基質に対する受容体であるインテグリン分子に着目し、以下のような研究戦略に基づき実験をおこなった。1.ヒト正常大腸組織(crypts)におけるインテグリン分子の発現をその局在に注目し検討した。十分なインフォームド・コンセントを患者およびその家族より得た上で、大腸癌手術時に得られる大腸摘出材料を用いて正常大腸組織凍結切片を作成した。12種類のα及びβインテグリン抗体による免疫蛍光組織染色を施行し、cryptsにおけるインテグリンの発現分布を検討した結果、β1インテグリンがStem cellsが存在するといわれているcrypt底部に強発現していることを見出した。2.Flow cytometryにより、正常大腸上皮細胞(crypt cells)におけるインテグリン発現を解析した。上記と同様の方法にて得られた正常大腸組織粘膜をEDTA/DTT及びpancreatinを用いてsingle cellsの状態に分離後(Whitehead et al.,Gastroenterology 117(4):858-865,1999)、インテグリン抗体を用いて蛍光免疫細胞染色をおこない、flow cytometryによりインテグリンの発現様式を解析した。Stem cellの存在するcryptsの底部付近にのみ強発現するβ1インテグリンにおける解析では、2峰性のピーク(インテグリン強発現群と低発現群)が認められ、強発現群の細胞がStem cellsが存在するといわれているcrypt底部から分離された細胞集団である可能性が推測された。3.上記1,2で確認したStem cellsに特異的なβ1インテグリン発現に基づいて正常大腸組織粘膜からsingle crypt cellsを分離後、蛍光免疫細胞染色し、β1インテグリン強発現細胞のみをsortingした。この細胞集団を用いてsoft agarによるcolony assayによりコロニー形成能を観察しclonogenic potentialを評価した。β1インテグリン発現に基づいてsortingされた細胞群におけるコロニー形成能は、sortingされていない細胞群(control)に比し、有意に高かった。以上より、β1インテグリンは大腸Stem cellsのマーカー分子となり得る可能性が示唆された。

Large intestineStem cellsのマーカーmolecule を同定するため、extracellular matrix に対するreceptor であるインテグリンmolecule に目し、The following のような research strategy is based on the づき実験をおこなった. 1. Normal large intestine tissue (crypts) is of great concern to the molecular structure of the large intestine. Ten なインフォームド・コンセントをPatient およびそのfamily より得た上で, large intestine The large intestine removal material obtained during cancer surgery is made from frozen sections of normal large intestine tissue. 12 kinds of anti-α and anti-β antibodies, immunohistochemical staining, cryp tsにおけるインテグリンの発existing distributionを検questionしたresult,β1インテグリンがStem Cells exist at the bottom of the crypt and the cells appear at the bottom of the cell. 2. Flow cytometry and analysis of normal large intestinal epithelial cells (crypt cells). The same method as mentioned above was used to obtain the normal large intestine tissue mucosa using EDTA/DTT and pancreatin in the same state as single cells (Whitehead et al., Gastroenterology 117(4):858-865,1999), インテグリン antibody をいて荍光immunocyte staining をおこない, flow Cytometry is a type of analysis. Stem Cell's existence and crypts' bottom pay near and strong 発appears and analyzes itは, 2 kurtosis のピーク(インテグリン强発 appear group and low 発appear group)がcognitionめられ, 强発appear群のStem The existence of cells means the bottom of the crypt and the separation of cells. The probability of cells gathering means speculation. 3. The above mentioned 1 and 2 are confirmed to be specific to Stem cells and are specific to the normal large intestine tissue mucosa single crypt. After the cells were separated, the cells were stained and sorted by immunocytochemistry for β1 sterilization.このCell Collection をUse いてsoft agar によるcolony assay によりコロニー to form an energy を観看しclonogenic potentialをreview価した. β1インテグリン発appears based on sorting and cell cluster forming abilityは, sorting されていないcell group (control) に比し, intentional に高かった. The above より, β1 インテグリンは large intestine Stem cells のマーカーmolecule となり has the possibility to show the instigation された.

项目成果

Koji Fujimoto et al.: "p53,p21^<WAF1/CIP1>, and Ras involvement in proliferation in conditionally immortalized pancreatic epithelial cells."Pancreas. 25・4. 428 (2002)

Koji Fujimoto 等人：“p53、p21^<WAF1/CIP1> 和 Ras 参与条件永生化胰腺上皮细胞的增殖。”胰腺 25・4（2002）。

藤本康二ら: "膵癌に対する化学療法指針"外科. 65・11. 1260-1264 (2003)

Koji Fujimoto 等：“胰腺癌化疗指南”Surg. 65・111（2003）。

Daisuke Ito, et al.: "Chronic exposure of transforming growth factor-beta 1 confers a more aggressive tumor phenotype through downregulation of p21^<WAF1/CIP1> in conditionally immortalized pancreatic epithelial cells"Surgery. (In press).

Daisuke Ito 等人：“在条件永生化的胰腺上皮细胞中，长期暴露于转化生长因子-β1，通过下调 p21^<WAF1/CIP1> 赋予更具侵袭性的肿瘤表型”。

藤本康二: "高齢者における膵癌の外科治療"老年消化器病. 14・1. 21-24 (2002)

藤本浩二：“老年人胰腺癌的手术治疗”《老年胃肠病学》14・1（2002）。

藤本康二: "膵内分泌腫瘍術後の膵液瘻"内分泌外科. 19・1. 29-34 (2002)

藤本浩二：“胰腺内分泌肿瘤手术后的胰瘘”19・1（2002）。