人為的酸化ストレス負荷によるアポートシスの抑制-Jurkat細胞、ヒト好中球、ラット肝細胞を用いた研究-

人工氧化应激抑制细胞凋亡 -使用 Jurkat 细胞、人中性粒细胞和大鼠肝细胞的研究 -

基本信息

批准号：
14657388
负责人：
荒井俊之
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

人為的酸化ストレスが種々の細胞のアポトーシスを抑制するか否かを検討するため、以下の研究を行った。1.JurkatヒトT細胞に、抗ヒトFasモノクロール抗体にて、アポトーシスを誘導した(約4時間)。この時、外因性の人為的酸化ストレスとして過酸化水素を、内因性の人為的酸化ストレスとして細胞内で過酸化水素を産生する6-ホルミルプテリン(6FP)を負荷した。アポトーシスの程度は、ヨウ化プロピジウム(PI)とフローサイトメトリーを用いて、核の断片化を定量化することにより、評価した。結果、100μMの過酸化水素はアポトーシスを抑制せず、逆に促進した。一方、10-250μMの6FPはアポトーシスを抑制した。この時、カスパーゼ3の活性化を、活性型カスパーゼ3抗体とフローサイトメトリーを用いて測定したところ、その活性化は抑制されていた。これより、内因性の人為的酸化ストレスがアポトーシスを抑制する可能性が示された。2.ヒト好中球は、in vitroでは自発的にアポトーシスが進行する(約24時間)。過酸化水素ならびに6FPが、この自発的アポトーシスにおよぼす影響を検討した。100μMの過酸化水素は何ら影響をおよぼさなかったが、100-250μMの6FPはアポトーシスを抑制した。この時、カスパーゼ3の活性化をイムノブロッティングにより、カスパーゼ3の活性を蛍光マイクロプレートリーダにより測定したところ、その活性化と活性は抑制されていた。これより、内因性の人為的酸化ストレスがアポトーシスを抑制する可能性が示された。3.ラット初代培養肝細胞に腫瘍壊死因子(TNF-α)と転写阻害剤アクチノマイシンDを加えるとアポトーシスが誘導される(約16時間)。過酸化水素ならびに6FPが、このアポトーシスにおよぼす影響を検討したところ、100μMの過酸化水素はアポトーシスを抑制せず、逆に促進した。一方、100-250μMの6FPはこのアポトーシスを抑制した。この時、カスパーゼ3の活性を基質と蛍光マイクロプレートリーダを用いて測定したところ、その活性は抑制されていた。これまた、内因性の人為的酸化ストレスがアポトーシスを抑制する可能性が示された。以上の結果より、種々の細胞において、人為的に特に内因性に酸化ストレスを負荷することで、アポトーシスの成立を阻止し、細胞死を防ぎうるか可能性が示された。

为了研究人为氧化应激是否抑制各种细胞中的凋亡，进行了以下研究。 1。在用抗人Fas单克隆抗体（约4小时）的Jurkat人T细胞中诱导凋亡。目前，将过氧化氢用作外源性人造氧化应激，而6-甲基甲基甲基氧化应激（6FP）应用于细胞中的过氧化氢作为内源性人造氧化应激。通过使用碘化丙啶（PI）和流式细胞仪来量化核碎片来评估凋亡的程度。结果，100μM过氧化氢没有抑制细胞凋亡，而是促进了凋亡。同时，10-250μM6FP抑制了凋亡。目前，使用活性caspase 3抗体和流式细胞仪测量caspase 3的激活，并抑制其激活。这表明内源性人工氧化应激可能抑制凋亡。 2。人中性粒细胞在体外自发凋亡（约24小时）。研究了过氧化氢和6FP对这种自发凋亡的影响。 100μM过氧化氢没有作用，但是100-250μm6fp抑制了凋亡。此时，通过免疫印迹测量了caspase 3的激活，caspase 3的活性由荧光微孔板读取器确定，并抑制其激活和活性。这表明内源性人工氧化应激可能抑制凋亡。 3。将肿瘤坏死因子（TNF-α）和转录抑制剂放线霉素D到原代培养的大鼠肝细胞中诱导凋亡（约16小时）。当我们研究过氧化氢和6FP对凋亡的影响时，100μM过氧化氢不会抑制凋亡，而是促进了凋亡。同时，100-250μm6fp抑制了这种细胞凋亡。目前，使用底物和荧光微孔板读取器测量caspase 3的活性，并抑制其活性。这还表明内源性人工氧化应激可能抑制凋亡。以上结果表明，有可能对各种细胞产生内源性作用的人为加载氧化应激可以防止凋亡的建立并防止细胞死亡。