骨髄間質細胞から膀胱組織の再生医療に関する研究

平成14年度ではマウス骨髄間質細胞を脱メチル化剤により分化し尿路上皮および平滑筋特異的タンパクのpromoterにGFPを組み込んだ発現ベクターで単離を試みたがうまくいかなかった。そこで今年度は脱メチル化剤の濃度、作用時間を変えて培養したマウス骨髄間質細胞からmRNAを抽出しRT-PCRを用いてスクリーニングしたところ、尿路上皮特異蛋白であるUroplakin-3 (UP3)、平滑筋蛋白であるSMAAの増幅が見られた。そこでFACSによる単離を試みたが、抗UP3抗体の入手ができなかったためSMAAのみ行った。しかしながらSMAA陽性に分化した細胞数が少なかったためかflowcytometryでは明らかなピークが得られず、やはり単離回収が困難であり、脱メチル化剤による分化誘導には限界が認められた。そこで発想を転換し、マウス膀胱より採取した平滑筋細胞を培養しその培養上清で骨髄間質細胞を培養したところ、間質細胞から平滑筋細胞に似た細胞が分化した。この細胞を回収しウェスタンブロッティングで各蛋白の発現パターンをみたところ膀胱平滑筋細胞の発現パターンと一致した。以上のことから膀胱平滑筋細胞培養上清中には間質未分化幹細胞から平滑筋に分化誘導する物質が含まれていることが類推された。現在平滑筋細胞上清中のどの物質が平滑筋分化の役割を担っているかを分画を作り検討中している。また膀胱上皮への分化は当研究期間中に達成できなかったが、現在マウス正常尿路上皮から初代培養した細胞を使って、共培養することにより組織のリモデリングができるかどうかを検討している。

平成14年度ではマウス骨髄間質細胞を脱メチル化剤により分化し尿路上皮および平滑筋特異的タンパクのpromoterにGFPを組み込んだ発現ベクターで単離を試みたがうまくいかなかった。そこで今年度は脱メチル化剤の濃度、作用時間を変えて培養したマウス骨髄間質細胞からmRNAを抽出しRT-PCRを用いてスクリーニングしたところ、尿路上皮特異蛋白であるUroplakin-3 (UP3)、平滑筋蛋白であるSMAAの増幅が見られた。そこでFACSによる単離を試みたが、抗UP3抗体の入手ができなかったためSMAAのみ行った。しかしながらSMAA陽性に分化した細胞数が少なかったためかflowcytometryでは明らかなピークが得られず、やはり単離回収が困難であり、脱メチル化剤による分化誘導には限界が認められた。そこで発想を転換し、マウス膀胱より採取した平滑筋細胞を培養しその培養上清で骨髄間質細胞を培養したところ、間質細胞から平滑筋細胞に似た細胞が分化した。この細胞を回収しウェスタンブロッティングで各蛋白の発現パターンをみたところ膀胱平滑筋細胞の発現パターンと一致した。以上のことから膀胱平滑筋細胞培養上清中には間質未分化幹細胞から平滑筋に分化誘導する物質が含まれていることが類推された。現在平滑筋細胞上清中のどの物質が平滑筋分化の役割を担っているかを分画を作り検討中している。また膀胱上皮への分化は当研究期間中に達成できなかったが、現在マウス正常尿路上皮から初代培養した細胞を使って、共培養することにより組織のリモデリングができるかどうかを検討している。