マトリックスメタロプロテイナーゼ-7の構造と機能の分子論的解析および阻害剤の開発

基质金属蛋白酶7结构与功能的分子分析及抑制剂的开发

基本信息

批准号：
14658203
负责人：
井上國世
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト・マトリックスメタロプロテイナーゼ-7(MMP7)は高い蛋白質分解活性をもち、癌転移に関与することが知られている。本酵素の阻害物質は有効な癌治療薬になる可能がある。pH5-9の広いpH域に特徴的な最適pHを有している。本酵素の反応機構は不明である。我々が行なってきたこれまでの研究から、酸性側の活性解離基としてGlu198またはZnルイス酸、塩基性側の活性解離基としてTyr216やTyr219などの可能性が考えられた。今回、塩基性側の活性解離基の同定と役割を解明することを目的とした。部位特異的変異導入により、活性部位に存在する3個のTyr残基(Tyr193,Tyr216,Tyr219)をそれぞれPheに変換した。野生型酵素では、酸性側pKa(pK_1)は4.4、塩基性側pKa(pK_2)は9.8である。Tyr193PheとTyr216Pheは、野生型とほぼ同じpK_1とpK_2値を示した。一方、Tyr219Pheでは、それぞれ5.7と9.4となり、pK_1が1.3ユニットも塩基性側にシフトした。いずれの変異酵素も最適pHでの酵素活性はほぼ同程度であり、以上の変異導入は固有の酵素活性には影響を及ぼさないことが示された。上で示されたpKaのシフトは、Tyr219が塩基性側の活性解離基ではないこと、またその水酸基が塩基性側解離基に直接的な影響を及ぼさないこと、ただし、Tyr219の水酸基により酸性側解離基はプロトン解離が促進されることが示された。塩基性側解離基の同定は未解明のまま残されたが、反応機構の解析において特異で貴重な知見が得られた。

人基质金属蛋白酶-7（MMP7）具有高蛋白水解活性，已知参与癌症转移。该酶的抑制剂可能是有效的癌症治疗方法。它具有pH 5-9的广泛pH范围的最佳pH值。该酶的反应机理尚不清楚。我们已经进行的先前研究表明，Glu198或Zn Lewis酸被用作酸侧的主动解离组，而Tyr216或Tyr219用作基本侧的主动解离组。在本文中，目的是识别和阐明主动解离组在基本方面的作用。定点诱变分别将活性位点中存在的三个Tyr残基（Tyr193，Tyr216，Tyr219）转化为PHE。在野生型酶中，酸性侧PKA（PK_1）为4.4，基本侧PKA（PK_2）为9.8。 Tyr193Phe和Tyr216Phe显示出与野生型几乎相同的PK_1和PK_BINAL值。同时，在Tyr219phe中，PK_1分别为5.7和9.4，PK_1的1.3单位也转移到了基本方面。两种突变酶在最佳pH值下具有几乎相同的酶活性，并且表明上述突变引入对内在酶活性没有影响。上面描述的PKA偏移表明Tyr219不是基本侧的主动解离组，并且其羟基并不直接影响基本侧分离基团，而是Tyr219的羟基促进了酸性解离组的质子分离。尽管基本解离组的鉴定仍然不清楚，但在分析反应机理时仍获得了独特而有价值的发现。