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酵素免疫測定法の高感度化を目的とした酵素反応シンクロナイゼーション系の開発

开发酶反应同步系统以提高酶免疫分析的灵敏度

基本信息

批准号：
11167248
负责人：
井上國世
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

酵素免疫測定法にカップルして、検出感度を増幅できる3酵素シンクロナイゼーション系の開発を検討した。alkaline phosphatase(ALP),alcohol dehydrogenase(ADH),diaphorase(DIA)の3酵素が効率よく作用するための条件を最適化した。DIAは不安定であり、適用できる温度、pH条件が狭いため、DIAの代わりに電子メディエータPMSを用いて再検討したところ、DIAより安価で、安定した触媒活性が得られた。DIAおよびPMSの基質としては、従来、INT(不溶性テトラゾリウム)が使用してきたが、不溶性の生成物フォルマザンが感度低下をもたらすため、今回、可溶性テトラゾリウム(WST-1)に変更した。WST-1を用いることにより、反応時間は30分から200分までのばすことができた。また、ALPの基質であるNADP+中に約0.1%のNAD+の混入が認められ、このことがバックグラウンドの原因となることが示された。HPLCによりNADP+を精製したところ、バックグラウンドを1/10に低減させることができた。ヒトのC反応性蛋白質(CRP)を抗原とするサンドイッチ酵素免疫測定法に、今回開発したシンクロナイゼーション系をカップルさせたCRP検出系を開発した。60分の反応で、50attomoleのCRPが検出可能であることが示された。本検出感度は臨床的に充分適用可能な感度である。p-ニトロフェニルホスフェートを基質とする従来法(1酵素系)に比べて、1000倍以上高感度であった。今後、ADH中にコンタミしているALPを除去することにより、より高感度化が期待される。

The enzyme immunoassay was developed to detect the increase in the sensitivity of the enzyme. Alkaline phosphatase(ALP),alcohol dehydrogenase(ADH) and diaphorase(DIA) are three enzymes that are optimized for their effects. DIA is unstable, suitable for temperature, pH conditions, DIA is stable, and catalyst activity is stable. DIA and PMS substrates are used in combination with insoluble and soluble substances. WST-1:30 minutes, 200 minutes, 30 minutes, 30 minutes About 0.1% of NAD+ was mixed into NADP+ in the matrix of ALP. HPLC: NADP+ is refined to 1/10 of its original value. C-reactive protein (CRP) antigen detection system developed by enzyme immunoassay 60 minutes of reverse, 50attomole of CRP detection is possible. The sensitivity of this test is fully applicable to clinical conditions. The p-enzyme system has a sensitivity of more than 1000 times higher than that of the substrate. In the future, the ALP will be removed from the media, and the sensitivity will be improved.