酵素免疫測定法の高感度化を目的とした酵素反応シンクロナイゼーション系の開発

开发酶反应同步系统以提高酶免疫分析的灵敏度

基本信息

批准号：
11167248
负责人：
井上國世
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

酵素免疫測定法にカップルして、検出感度を増幅できる3酵素シンクロナイゼーション系の開発を検討した。alkaline phosphatase(ALP),alcohol dehydrogenase(ADH),diaphorase(DIA)の3酵素が効率よく作用するための条件を最適化した。DIAは不安定であり、適用できる温度、pH条件が狭いため、DIAの代わりに電子メディエータPMSを用いて再検討したところ、DIAより安価で、安定した触媒活性が得られた。DIAおよびPMSの基質としては、従来、INT(不溶性テトラゾリウム)が使用してきたが、不溶性の生成物フォルマザンが感度低下をもたらすため、今回、可溶性テトラゾリウム(WST-1)に変更した。WST-1を用いることにより、反応時間は30分から200分までのばすことができた。また、ALPの基質であるNADP+中に約0.1%のNAD+の混入が認められ、このことがバックグラウンドの原因となることが示された。HPLCによりNADP+を精製したところ、バックグラウンドを1/10に低減させることができた。ヒトのC反応性蛋白質(CRP)を抗原とするサンドイッチ酵素免疫測定法に、今回開発したシンクロナイゼーション系をカップルさせたCRP検出系を開発した。60分の反応で、50attomoleのCRPが検出可能であることが示された。本検出感度は臨床的に充分適用可能な感度である。p-ニトロフェニルホスフェートを基質とする従来法(1酵素系)に比べて、1000倍以上高感度であった。今後、ADH中にコンタミしているALPを除去することにより、より高感度化が期待される。

我们研究了三酶同步系统的发展，该系统可以通过与酶免疫测定结合来扩大检测灵敏度。优化了三种酶，碱性磷酸酶（ALP），酒精脱氢酶（ADH）和diaphorase（DIA）的有效作用的条件。由于DIA是不稳定的，并且适用的温度和pH条件狭窄，因此我们使用电子介质PMS而不是DIA重新检查，发现它比DIA更便宜且稳定。 INT（不溶性四唑）已被用作DIA和PMS的底物，但不溶性产物formazane现在已更改为可溶性四唑（WST-1），因为它降低了灵敏度。通过使用WST-1，反应时间可以从30分钟延长至200分钟。此外，发现大约0.1％的NAD+在NADP+（ALP的基板）中被污染，这表明这是背景的原因。通过HPLC纯化NADP+允许减少背景的1/10。我们已经开发了一种CRP检测系统，该系统将使用人C反应蛋白（CRP）作为抗原开发的同步系统与三明治酶免疫测定法相结合。 60分钟的反应表明，可以检测到50个Attomole CRP。这种检测灵敏度是一种敏感的，在临床上足够适用。与传统方法（一种酶系统）相比，该方法使用p-硝基苯基作为底物，它的敏感性高1000倍。将来，预计在ADH期间被污染的ALP将被删除以提高灵敏度。