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電気穿孔法による蛍光標識蛋白質の細胞内導入:鞭毛蛋白質動態解析への応用

通过电穿孔将荧光标记蛋白引入细胞内：在鞭毛蛋白动力学分析中的应用

基本信息

批准号：
14658211
负责人：
神谷律
金额：
$ 2.5万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は,真核生物鞭毛の内部構造(軸糸)を構成する蛋白質の動態を直接観察することを目的にした.精密機械のような整然とした軸糸構造がどのように形成され,維持されているかは,未解明の大きな問題である.これまでこの軸糸構造は構造全体が解体再生する場合をのぞいて,きわめて安定に保持されていると考えられてきたか,最近、定常状態においても蛋白質がダイナミックにターンオーバーしているという実験結果が報告されはじめた.これが事実であるとすると,鞭毛構築機構は再考を迫られることになる.しかし,これらの知見は単離・固定した試料の解析に基づくもので,そのダイナミックな過程を直接検証した研究はまだない.本研究では,クラミドモナス生細胞に蛍光標識した軸糸蛋白質を電気穿孔法で導入して鞭毛軸糸内に取り込ませるという,以前我々が開発した方法を利用し,蛍光退色・回復実験を行った.すなわち,蛍光標識蛋白質をとりこんだ鞭毛軸糸の小部分を光退色させ,その部位の蛍光が時間とともに回復するか否かを検出する実験である.その結果、軸糸蛋白質であるアクチンか数十分という時定数でターンオーバーしていることを示すことに成功した。鞭毛内のアクチンは主にダイニン内腕のサブユニットとして存在するので,このことはダイニン内腕が生細胞の鞭毛内で動的にターンオーバーしていることを示唆する.今年度はさらに、組み換え蛋白質として発現したダイニン外腕のサブユニットを蛍光標識し、ダイニンの内腕と外腕のターンオーバー速度に差があるか否かを検討した。現在のところごく少量の外腕サブユニットしか鞭毛内へとりこまれないために蛍光退色実験を行うまでに至っていないが、遠からず、軸糸内の様々な蛋白質の動態がこの方法で明らかにされることと期待される。

This study aims to investigate the protein dynamics of eukaryotic flagella structure (axis) directly. Precision machinery and precision machinery. The structure of this axis is completely decomposed and regenerated. The stability of the structure is maintained. The protein in the recent and steady state is reported. The flagellum construction mechanism is reexamined. The analysis of the samples was carried out on the basis of the experimental data, and the direct verification of the experimental data was carried out on the basis of the experimental data. In this study, we developed a new method to detect the protein in the flagella axis by electroporation, which was used to detect the protein in flagella axis. The light marks the protein, and the light of the part of the flagella axis fades. The result is that the number of axis proteins is very high. The number of axis proteins is very high. In the flagella, the main body of the inner arm of the flagella exists, and the inner arm of the flagella moves. This year, the protein content of the protein is changed, and the protein content of the protein is changed. Now, there is a small amount of light fading inside the flagella, and the protein dynamics inside the shaft are clearly and expectantly achieved.