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ジーン・ガンによる中枢ニューロンヘのシグナリング試薬・細胞内ローディング

Gene Gan 的信号试剂和细胞内负载至中枢神经元

基本信息

批准号：
15650075
负责人：
田端俊英
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ニューロンの細胞内シグナリングを分析するために有用な試薬のほとんどが親水性すなわち低細胞膜透過性であり、生きた細胞標本に投与することが困難である。本研究では遺伝子導入に利用されているジーン・ガン(空気銃)を応用して、親水性試薬を付着させた弾丸(金属微粒子)を細胞内投与する技術の開発に取り組んだ。本年度は昨年度に開発した基礎技術の洗練と実用化を目指した。(1)中枢ニューロンへの最適化:培養マウス小脳ニューロンをモデルとして投与プロトコールを改良した。射出ガス圧を上げると細胞内導入効率が増すが、衝撃波や爆風により細胞が傷害された。この問題は昨年度に開発した爆風回避装置と低ガス圧(80〜90psi)で何回かに分けて投与を行うプロトコールを用いることで大幅に改善できた。弾丸が通過する培地層を厚くすることで細胞が保護できるかも検討したが、培地層が数ミリメーターを越えると導入効率が急激に低下してしまうことが分かった。(2)投与濃度のコントロール:一定の濃度の試薬を細胞内投与するためには、i.弾丸に付着した試薬の濃度、ii.薬莢に含まれる弾丸の数などが重要なファクターであることが分かった。iについては直径の小さな(0.6ミクロン)研磨済み金粒子の方が、直径が大きく(1ミクロン)表面に凹凸があるタングステン粒子より試薬の付着濃度が一定することが分かった。iiは薬莢の製造ムラに起因するもので、a)薬莢を使用前に蛍光顕微鏡で直接検査して弾丸数の揃ったロットに選り分けるとともに、b)それぞれのロットのサンプルでパラフィルムに向かって試射を行い、パラフィルムに命中した弾丸の密度から細胞内導入効率を予測することで概ね解決できた。蛍光カルシウムインジケーターをモデル試薬とした比較では、ジーン・ガンによる細胞内導入後5〜10分での細胞内蛍光輝度が、従来のパッチクランプ記録電極から細胞内に拡散させる方法で数十分投与した場合よりも強く、ジーン・ガンによってカルシウム濃度の測定や制御に十分な濃度の試薬を細胞内投与できることが分かった。

It is difficult to analyze the intracellular structure of the cell membrane with low permeability and low hydrophilicity. In this study, we developed a new technique for the intracellular delivery of DNA by using a hydrophilic reagent and a metal microparticle. This year, the development of basic technology and implementation of the target (1)Optimization of central nervous system: culture and improvement of central nervous system The rate of intracellular induction of blast and blast increases, causing damage to cells. This problem has been greatly improved since last year when the blast avoidance device and low pressure (80 ~ 90psi) were introduced. In addition, the number of cells in the formation is increased rapidly. (2)The concentration of the drug administered into the cell: a certain concentration of the drug administered into the cell; i. the concentration of the drug administered into the cell; ii. the number of the drug administered into the cell. The diameter of the particle is small (0.6 mm), the diameter of the particle is large (1 mm), the surface is uneven, and the particle concentration is constant. ii. The causes of production of the drug, a) direct detection of the number and selection of the drug by optical microscopy before use of the drug, b) direct detection of the number and selection of the drug by optical microscopy before use of the drug, and b) prediction of the intracellular introduction rate of the drug by optical microscopy. 5 - 10 minutes after intracellular introduction, the intracellular luminosity of the light is measured by the method of measuring the concentration of the light in the cell, and the concentration of the light in the cell is measured by the method of measuring the concentration of the light in the cell.