ジーン・ガンによる中枢ニューロンヘのシグナリング試薬・細胞内ローディング

Gene Gan 的信号试剂和细胞内负载至中枢神经元

• 批准号: 15650075
• 负责人: 田端 俊英
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15650075/
• 关键词: ジーンガン; ニューロン; 細胞内シグナリング; 細胞内投与; ジーン・ガン

ニューロンの細胞内シグナリングを分析するために有用な試薬のほとんどが親水性すなわち低細胞膜透過性であり、生きた細胞標本に投与することが困難である。本研究では遺伝子導入に利用されているジーン・ガン(空気銃)を応用して、親水性試薬を付着させた弾丸(金属微粒子)を細胞内投与する技術の開発に取り組んだ。本年度は昨年度に開発した基礎技術の洗練と実用化を目指した。(1)中枢ニューロンへの最適化:培養マウス小脳ニューロンをモデルとして投与プロトコールを改良した。射出ガス圧を上げると細胞内導入効率が増すが、衝撃波や爆風により細胞が傷害された。この問題は昨年度に開発した爆風回避装置と低ガス圧(80〜90psi)で何回かに分けて投与を行うプロトコールを用いることで大幅に改善できた。弾丸が通過する培地層を厚くすることで細胞が保護できるかも検討したが、培地層が数ミリメーターを越えると導入効率が急激に低下してしまうことが分かった。(2)投与濃度のコントロール:一定の濃度の試薬を細胞内投与するためには、i.弾丸に付着した試薬の濃度、ii.薬莢に含まれる弾丸の数などが重要なファクターであることが分かった。iについては直径の小さな(0.6ミクロン)研磨済み金粒子の方が、直径が大きく(1ミクロン)表面に凹凸があるタングステン粒子より試薬の付着濃度が一定することが分かった。iiは薬莢の製造ムラに起因するもので、a)薬莢を使用前に蛍光顕微鏡で直接検査して弾丸数の揃ったロットに選り分けるとともに、b)それぞれのロットのサンプルでパラフィルムに向かって試射を行い、パラフィルムに命中した弾丸の密度から細胞内導入効率を予測することで概ね解決できた。蛍光カルシウムインジケーターをモデル試薬とした比較では、ジーン・ガンによる細胞内導入後5〜10分での細胞内蛍光輝度が、従来のパッチクランプ記録電極から細胞内に拡散させる方法で数十分投与した場合よりも強く、ジーン・ガンによってカルシウム濃度の測定や制御に十分な濃度の試薬を細胞内投与できることが分かった。

ニ ュ ー ロ ン の intracellular シ グ ナ リ ン グ を analysis す る た め に useful な try 薬 の ほ と ん ど が hydrophilic す な わ ち low membrane permeability で あ り, raw き た cell specimens cast with す に る こ と が difficult で あ る. This study で は posthumous son 伝 import に using さ れ て い る ジ ー ン · ガ ン (empty 気 spear) を 応 with し て, hydrophilic try 薬 を pay the さ せ た 弾 pill (metal particles) cast with す を cell る technology の open 発 に group take り ん だ. This year に The previous year に developed た basic technology <s:1> refined と practical application を target た た. (1) the central ニ ュ ー ロ ン へ の optimization: cultivate マ ウ ス small 脳 ニ ュ ー ロ ン を モ デ ル と し て cast with プ ロ ト コ ー ル を improved し た. On injection ガ ス 圧 を げ る と が cells into sharper rate raised す が や detonation and shock wave wind に よ が り cell damage さ れ た. こ の problem は yesterday annual に open 発 し た low blasting wind avoidance device と ガ ス 圧 (80 ~ 90 psi) what で back か に points け て cast with を う プ ロ ト コ ー ル を with い る こ と で に significantly improve で き た. 弾 pill が through す る culture formation を thick く す る こ と が で cells protect で き る か も beg し 検 た が, culture formation が ミ リ メ ー タ ー を more え る と import working rate low が nasty shock に し て し ま う こ と が points か っ た. (2) Administration concentration: <s:1> コ トロ トロ トロ トロ するために : a certain <s:1> concentration of the <s:1> drug is administered intravenously to を, するために, and i. Try 弾 pill に pay the し た 薬 の concentration, ii. 薬 に pods containing ま れ る 弾 pill の number な ど が important な フ ァ ク タ ー で あ る こ と が points か っ た. I に つ い て は の small diameter さ な (0.6 ミ ク ロ ン) grinding 済 の party が み gold particles, large diameter が き く (1 ミ ク ロ ン) に concave and convex surface が あ る タ ン グ ス テ ン particle よ り try 薬 の が must pay the concentration す る こ と が points か っ た. Ii は 薬 pod の manufacturing ム ラ に cause す る も の で 薬 pod, a) を before use に 蛍 light 顕 micromirror で 検 directly check し て 弾 pill for の Jian っ た ロ ッ ト に choose り points け る と と も に, b) そ れ ぞ れ の ロ ッ ト の サ ン プ ル で パ ラ フ ィ ル ム に to か っ て test を い, パ ラ フ ィ ル ム に hit し た 弾 pill の density か ら を import working rate in the cell It is presumed that する とで とで is approximately ね to solve で た た. 蛍 light カ ル シ ウ ム イ ン ジ ケ ー タ ー を モ デ ル try 薬 と し た compare で は, ジ ー ン · ガ ン に よ る cells after import 5 ~ 10 points で の 蛍 degrees が glory in the cell, the 従 の パ ッ チ ク ラ ン プ recording electrodes か ら intracellular に company, scattered さ せ る method で cast with dozens of points し た occasions よ り も く, ジ ー ン · ガ ン に よ っ て カ ル シ ウ の ム concentration To determine the intracellular administration of the や prepared に at a concentration of 10 な fractions of the <s:1> drug を and で る る <s:1> とが とが とが った.

项目成果

T.Tabata, Y.Fukudome: "Insulin-like growth factor-I as a promoting factor for cerebellar Purkinje cell development"European Journal of Neuroscience. 17・10. 2006-2016 (2003)

T.Tabata，Y.Fukudome：“胰岛素样生长因子-I 作为小脑浦肯野细胞发育的促进因子”欧洲神经科学杂志 17・10 2006-2016（2003）。

Calcium dependence of native metabotropic glutamate receptor signaling in central neurons

• DOI: 10.1385/mn:29:3:261
• 发表时间: 2004-06
• 期刊: Molecular Neurobiology
• 影响因子: 5.1
• 作者: T. Tabata;M. Kano

Altered agonist sensitivity and desensitization of neuronal mGluR1 responses in knock-in mice by a single amino acid substitution at the PKC phosphorylation site.

通过 PKC 磷酸化位点的单个氨基酸取代，改变了敲入小鼠中激动剂的敏感性和神经元 mGluR1 反应的脱敏。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Eur J Neurosci. 20
• 作者: Tabata T;Sato M
• 通讯作者: Sato M

Ca^<2+> activity at GABA_B receptor constitutively promotes metabotropic glutamate signaling in the absence of GABA

GABA_B 受体的 Ca^2 活性在缺乏 GABA 的情况下持续促进代谢型谷氨酸信号传导

• 发表时间: 2004
• 期刊: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101・48
• 作者: Tabata T;Tabata T
• 通讯作者: Tabata T

Insulin-like growth factor-I as a promoting factor for cerebellar Purkinje cell development

• DOI: 10.1046/j.1460-9568.2003.02640.x
• 发表时间: 2003-05-01
• 期刊: EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE
• 影响因子: 3.4
• 作者: Fukudome, Y;Tabata, T;Kano, M
• 通讯作者: Kano, M