糖転移酵素の基質特異性の多様さを決定する分子生物的メカニズムの解析

决定糖基转移酶底物特异性多样性的分子生物学机制分析

• 批准号: 62490016
• 负责人: 成松 久
• 金额: $ 3.33万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 1989
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-62490016/
• 关键词: 糖転移酵素; ガラクトシルトランスフェラ-ゼ; COS細胞トランスフェクション; ガラクトシルトランスフェラーゼ; 糖蛋白合成

マウスβ1ー4ガラクトシルトランスフェラ-ゼ(以下β1ー4GT)遺伝子の全ゲノムをクロ-ニングし、エクソン-イントロン部分を決定した。ゲノムは全長70kbに及び、7個のエクソンが存在することをエクソンーイントロン境界部分をシ-クエンスすることにより決定した。エクソン1、2、3間はそれぞれ約15kb以上離れておりクロ-ニングに手間どった。膜結合部位はエクソン1に、ORF終止部位はエクソン7にあった。エクソン3と6は、Alternativeにスプライスされ、活性をもつ酵素蛋白は、エクソン3をもたず6をもつエクソン1、2、4、5、6、7より成ることが判明した。エクソン3の塩基配列決定の結果、終止コドンが途中にあらわれ、エクソン3をもつmRNAは成塾酵素蛋白を翻訳できないことが明らかとなった。β1ー4GTとα1ー3GTとの一次構造比較の結果、エクソン6はUDPーGalとの結合ドメインであることが推定された。これをもたないmRNAの翻訳産物がどのような機能をもつのか興味のもたれるところである。マウスfull-length cDNAをpCMV4ベクタ-に組み換え、Cos細胞にトランスフェクトし、β1ー4GT酵素活性を発現させた。結果、GlcNac単糖及び非還元末端にGlcNacをもつAsialsー(As)、Agalactoー(Ag)Tramsferinなどの糖蛋白にはガラクト-スを転移するが、As、Agのムチン型糖蛋白には全く転移しないこと、またαdactoalbuminの存在下ではガラクト-スをグルコ-スに優位に転移すること、転移後はβーガラクトシダ-ゼ処理により分解されることなどより、確かにβ1ー4結合でガラクト-スをGlcNacに転移し、糖蛋白のうちNー結合型の合成にかかわる酵素活性を発輝することが確認できた。さらに酵素のKm値を種々のアクセプタ-を用いて決定し、このcDNAが発現する酵素蛋白が、従来の精製蛋白レベルで知られていたKm値と一致することが判明した。

The complete set of parameters for the β1 - 4 The total length of 70kb and 7 pieces of software are determined. The first, second, and third groups were about 15kb or more apart. Membrane binding site 1 ORF termination site 7 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 10 The gene sequence ofβ1 - 4GT and α1 - 3GT are the results of the first structural comparison. This is the first time I've ever seen a gene that's been cloned into a cell. The full-length cDNA of pCMV4 is expressed in Cos cells and β1-GT enzyme activity. The results showed that GlcNac and GlcNac could not be separated from Asials (As) and Agalacto (Ag)Tramsferin in the presence of αdactoalbumin, which could not be separated from As and Ag in the presence of αdactoalbumin. β1 - 4 binding is confirmed by enzyme activity in the synthesis of glycoproteins. The Km value of the enzyme is determined by the expression of the enzyme protein, and the Km value of the purified protein is determined by the expression of the cDNA.

项目成果

K.Nakazawa,K.Furukawa,A.Kobata and H.Narimatsu: "Transient Expression in Cos-F cells of Full-length Mouse N-Acetylglucosamine β1-4 Galactosyltransferase cDNA."

K. Nakazawa、K. Furukawa、A. Kobata 和 H. Narimatsu：“全长小鼠 N-乙酰葡糖胺 β1-4 半乳糖基转移酶 cDNA 在 Cos-F 细胞中的瞬时表达。”

K.Nakazawa,;T.ANDO,;T.Kimura,;H.Narimatsu,: J.Biochemistry. 104. 165-168 (1988)

K.Nakazawa,;T.ANDO,;T.Kimura,;H.Narimatsu,：J.生物化学。

K.Nakazawa,K.Iida,S.Komatsu,M.Yoshida and H,Narimatsu: "Tissue-specific and Developmental Stoge-dependent Expression of Mouse N-Acetylglucosamine β1-4 Gal TGene." Biochem.Biophys.Acta.

K. Nakazawa、K. Iida、S. Komatsu、M. Yoshida 和 H, Narimatsu：“小鼠 N-乙酰葡萄糖胺 β1-4 Gal TGene 的组织特异性和发育依赖性表达。”

K.Nakazawa,S.Komatsu and H,Narimatsu: "Genomic Structure of Mouse N-Acetylglucosamine β1-4 Galactosyltransferase Gene." manuscript.

K.Nakazawa、S.Komatsu 和 H,Narimatsu：“小鼠 N-乙酰葡萄糖胺 β1-4 半乳糖基转移酶基因的基因组结构手稿”。

成松久: 蛋白質,核酸,酵素. 32. 1291-1299 (1987)

成松恒：蛋白质、核酸、酶。32. 1291-1299 (1987)