新規なヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシドアナログの設計とその作用機構

使用新型核苷磷酸化酶设计核苷类似物及其作用机制

• 批准号: 04660116
• 负责人: 木村 光
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04660116/
• 关键词: プリンヌクレオシドホスホリラーゼ; ウリジンホスホリラーゼ; プロモーター; 塩基配列; ヌクレオシドアナログ; Klebsiella

本研究では、我々が土壌から単離した細菌Klebsiella spのユニークな基質特異性を持つプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPase)の誘導、及び触媒機構を分子レベルで明らかにすることを目的として、その遺伝子のクローニングと、一次構造解析を行なった。精製したPNPaseのN末端アミノ酸配列を10残基決定したところ、大腸菌のPNPaseのそれと一致した。そこで、大腸菌のPNPase遺伝子(deoD)の塩基配列を参考にして、20-merのオリゴヌクレオチドプローブを作製しPCRを行なった。Klebsiella spの染色体DNA断片を鋳型として増幅された約700bpのDNA断片の全塩基配列を決定したところ、239アミノ酸(分子量26、198)から成る読み枠が存在した。このDNA断片を大腸菌の発現ベクターpKK233-2に連結し、大腸菌のdeoD^-株に導入したところ、PNPase活性が検出され、本DNA断片上に機能し得るPNPase遺伝子が存在することを明らかにした。次に、この得られたDNA断片を用い、プロモーター領域を含む全長の遺伝子のクローニングを行なった。得られた遺伝子は大腸菌の-35,-10と相同性を示すプロモーター領域と、SD配列を持っていた。ところで、本菌においては、PNPaseはアデノシンによって誘導を受けるが、ウリジンによっても誘導を受ける。一方、ウリジンホスホリラーゼ(UNPase)も、ウリジンによっても、アデノシンによっても誘導を受ける。この大腸菌にはみられないユニークな誘導機構を分子レベルで明らかにするため、Klebsiella spのUNPase遺伝子を、先に同様の方法でクローニングし、その構造を決定した。UNPaseは278アミノ酸(分子量28.9/2)から成っていた。そのプロモーター領域をPNPase遺伝子のそれと比較したところ、5^1-TGTTCXGPuG-3^1から成る共通配列が、-35の上流4〜7bpに存在しており、この配列が誘導機構に関与している可能性を示唆した。

In this study, we conducted a study on the induction of substrate specificity, molecular structure and catalytic mechanism of Klebsiella sp, and the analysis of primary structure. The N-terminal amino acid sequence of purified PNase was determined by 10 residues. The DNA sequence of E. coli deoD was determined by PCR. The 20-mer DNA sequence was determined by PCR. Klebsiella sp chromosome DNA fragment type increased to about 700bp DNA fragment of the whole base alignment determined by the number of nucleotides (molecular weight 26, 198), the number of nucleotides still exists. This DNA fragment was linked to the discovery of Escherichia coli pKK233 -2 and introduced into the Escherichia coli deoD^-strain. It is now clear that PNPase activity has been detected and a functional PNPase gene exists on this DNA fragment. In the second place, the DNA fragments were obtained and used in the first place, and the DNA fragments were obtained in the second place. The identity of E. coli was-35,-10, and the domain and SD alignment were maintained. In this case, it is necessary for the bacteria to be purified and the PNase to be purified. A party, it's a party. These E. coli strains are capable of inducing molecular changes, Klebsiella sp., and their structures are determined by the same methods. UNPA 278 ACID (MW 28.9/2) The common alignment of 5^1-TGTTCXGPuG-3^1 and the upstream 4 ~ 7bp of-35 are shown in the comparison of the common alignment of PNase genes in different regions.