新規なヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシドアナログの設計とその作用機構

本研究では、我々が土壌から単離した細菌Klebsiella spのユニークな基質特異性を持つプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPase)の誘導、及び触媒機構を分子レベルで明らかにすることを目的として、その遺伝子のクローニングと、一次構造解析を行なった。精製したPNPaseのN末端アミノ酸配列を10残基決定したところ、大腸菌のPNPaseのそれと一致した。そこで、大腸菌のPNPase遺伝子(deoD)の塩基配列を参考にして、20-merのオリゴヌクレオチドプローブを作製しPCRを行なった。Klebsiella spの染色体DNA断片を鋳型として増幅された約700bpのDNA断片の全塩基配列を決定したところ、239アミノ酸(分子量26、198)から成る読み枠が存在した。このDNA断片を大腸菌の発現ベクターpKK233-2に連結し、大腸菌のdeoD^-株に導入したところ、PNPase活性が検出され、本DNA断片上に機能し得るPNPase遺伝子が存在することを明らかにした。次に、この得られたDNA断片を用い、プロモーター領域を含む全長の遺伝子のクローニングを行なった。得られた遺伝子は大腸菌の-35,-10と相同性を示すプロモーター領域と、SD配列を持っていた。ところで、本菌においては、PNPaseはアデノシンによって誘導を受けるが、ウリジンによっても誘導を受ける。一方、ウリジンホスホリラーゼ(UNPase)も、ウリジンによっても、アデノシンによっても誘導を受ける。この大腸菌にはみられないユニークな誘導機構を分子レベルで明らかにするため、Klebsiella spのUNPase遺伝子を、先に同様の方法でクローニングし、その構造を決定した。UNPaseは278アミノ酸(分子量28.9/2)から成っていた。そのプロモーター領域をPNPase遺伝子のそれと比較したところ、5^1-TGTTCXGPuG-3^1から成る共通配列が、-35の上流4〜7bpに存在しており、この配列が誘導機構に関与している可能性を示唆した。

本研究では、我々が土壌から単離した細菌Klebsiella spのユニークな基質特異性を持つプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPase)の誘導、及び触媒機構を分子レベルで明らかにすることを目的として、その遺伝子のクローニングと、一次構造解析を行なった。精製したPNPaseのN末端アミノ酸配列を10残基決定したところ、大腸菌のPNPaseのそれと一致した。そこで、大腸菌のPNPase遺伝子(deoD)の塩基配列を参考にして、20-merのオリゴヌクレオチドプローブを作製しPCRを行なった。Klebsiella spの染色体DNA断片を鋳型として増幅された約700bpのDNA断片の全塩基配列を決定したところ、239アミノ酸(分子量26、198)から成る読み枠が存在した。このDNA断片を大腸菌の発現ベクターpKK233-2に連結し、大腸菌のdeoD^-株に導入したところ、PNPase活性が検出され、本DNA断片上に機能し得るPNPase遺伝子が存在することを明らかにした。次に、この得られたDNA断片を用い、プロモーター領域を含む全長の遺伝子のクローニングを行なった。得られた遺伝子は大腸菌の-35,-10と相同性を示すプロモーター領域と、SD配列を持っていた。ところで、本菌においては、PNPaseはアデノシンによって誘導を受けるが、ウリジンによっても誘導を受ける。一方、ウリジンホスホリラーゼ(UNPase)も、ウリジンによっても、アデノシンによっても誘導を受ける。この大腸菌にはみられないユニークな誘導機構を分子レベルで明らかにするため、Klebsiella spのUNPase遺伝子を、先に同様の方法でクローニングし、その構造を決定した。UNPaseは278アミノ酸(分子量28.9/2)から成っていた。そのプロモーター領域をPNPase遺伝子のそれと比較したところ、5^1-TGTTCXGPuG-3^1から成る共通配列が、-35の上流4〜7bpに存在しており、この配列が誘導機構に関与している可能性を示唆した。