新規なヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシドアナログの設計とその作用機構

使用新型核苷磷酸化酶设计核苷类似物及其作用机制

• 批准号: 04660116
• 负责人: 木村 光
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04660116/
• 关键词: プリンヌクレオシドホスホリラーゼ; ウリジンホスホリラーゼ; プロモーター; 塩基配列; ヌクレオシドアナログ; Klebsiella

本研究では、我々が土壌から単離した細菌Klebsiella spのユニークな基質特異性を持つプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNPase)の誘導、及び触媒機構を分子レベルで明らかにすることを目的として、その遺伝子のクローニングと、一次構造解析を行なった。精製したPNPaseのN末端アミノ酸配列を10残基決定したところ、大腸菌のPNPaseのそれと一致した。そこで、大腸菌のPNPase遺伝子(deoD)の塩基配列を参考にして、20-merのオリゴヌクレオチドプローブを作製しPCRを行なった。Klebsiella spの染色体DNA断片を鋳型として増幅された約700bpのDNA断片の全塩基配列を決定したところ、239アミノ酸(分子量26、198)から成る読み枠が存在した。このDNA断片を大腸菌の発現ベクターpKK233-2に連結し、大腸菌のdeoD^-株に導入したところ、PNPase活性が検出され、本DNA断片上に機能し得るPNPase遺伝子が存在することを明らかにした。次に、この得られたDNA断片を用い、プロモーター領域を含む全長の遺伝子のクローニングを行なった。得られた遺伝子は大腸菌の-35,-10と相同性を示すプロモーター領域と、SD配列を持っていた。ところで、本菌においては、PNPaseはアデノシンによって誘導を受けるが、ウリジンによっても誘導を受ける。一方、ウリジンホスホリラーゼ(UNPase)も、ウリジンによっても、アデノシンによっても誘導を受ける。この大腸菌にはみられないユニークな誘導機構を分子レベルで明らかにするため、Klebsiella spのUNPase遺伝子を、先に同様の方法でクローニングし、その構造を決定した。UNPaseは278アミノ酸(分子量28.9/2)から成っていた。そのプロモーター領域をPNPase遺伝子のそれと比較したところ、5^1-TGTTCXGPuG-3^1から成る共通配列が、-35の上流4〜7bpに存在しており、この配列が誘導機構に関与している可能性を示唆した。

In this study, で で, I 々が soil ら単 ら単 isolated the た bacterium Klebsiella Sp の ユ ニ ー ク な substrate specificity を hold つ プ リ ン ヌ ク レ オ シ ド ホ ス ホ リ ラ ー ゼ (PNPase) の induction, and び catalyst institutions を molecular レ ベ ル で Ming ら か に す る こ と を purpose と し て, そ の posthumous son 伝 の ク ロ ー ニ ン グ と line, a structural analytic を な っ た. Refined し た PNPase の N terminal ア ミ ノ acid with column を 10 residue decided し た と こ ろ, coliform の PNPase の そ れ と consistent し た. そ こ で, coliform の PNPase heritage 伝 child (deoD) の salt base with column を reference に し て, 20 - killing の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ を cropping し PCR line を な っ た. Type Klebsiella sp の chromosome DNA fragment を where と し て rights of さ れ た about 700 bp DNA fragment の の salt base full column を decided し た と こ ろ, 239 ア ミ ノ acid (26, 198), the molecular weight of か ら into る 読 み 枠 が exist し た. こ の DNA fragment を coliform の 発 now ベ ク タ ー pKK233 link - 2 に し, coliform の deoD ^ - strain に import し た と こ ろ, PNPase activity が 検 out さ れ, this DNA fragment に function し る PNPase heritage 伝 son が exist す る こ と を Ming ら か に し た. に, こ の have ら れ た DNA fragment を い, プ ロ モ ー タ を ー field contains traces of length む の 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ を line な っ た. Son to ら れ た heritage 伝 は coliform の - 35, - 10 と identity を shown す プ ロ モ ー タ と ー field, SD with column を っ て い た. と こ ろ で, the bacteria に お い て は, PNPase は ア デ ノ シ ン に よ っ て induced を by け る が, ウ リ ジ ン に よ っ て も induced を by け る. One party, ウ リ ジ ン ホ ス ホ リ ラ ー ゼ UNPase も, ウ リ ジ ン に よ っ て も, ア デ ノ シ ン に よ っ て も induced を by け る. こ の coliform に は み ら れ な い ユ ニ ー ク な induced institutional を molecular レ ベ ル で Ming ら か に す る た め, Klebsiella sp の UNPase heritage 伝 を, に first with others の way で ク ロ ー ニ ン グ し, そ の tectonic を decided し た. UNPase ノ 278ア ノ ノ acid (molecular weight 28.9/2) ら ら って た た た. そ の プ ロ モ ー タ ー field を PNPase posthumous son 伝 の そ れ と compare し た と こ ろ 1 - TGTTCXGPuG - 3, 5 ^ ^ 1 か ら into common る match column が, 4 ~ 7-35 の high bp に exist し て お り, こ の match column が induced institutional に masato and し て い を る possibility in stopping し た.