抗酸菌感染症の診断におけるPCR診断の臨床応用に関する研究

PCR诊断在抗酸细菌感染诊断中的临床应用研究

• 批准号: 04670467
• 负责人: 山木戸 道郎
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04670467/
• 关键词: Mycobacteria; dnaJ gene; PCR; RFLP

【目的】抗酸菌dnaJ遺伝子領域にnested PCR(n-PCR)の系を設定し、抗酸菌感染症の迅速診断におけるその有用性を検討した。さらに、PCR生成物の塩基配列を決定し、制限酵素断片長多型(RFLP)解析により菌種鑑別が行い得るか否かを検討した。【結果】1)n-PCRによる検出限界は1反応あたりDNA量にして10fgであり、結核菌2菌体分に相当する量であった。2)特異性の検討では、結核菌群に属するすべての菌株および16菌種中11菌種の非定型抗酸菌株のDNAが増幅された。これらの非定型抗酸菌の中には、臨床的に重要な菌種である、M.kansasii、M.avium、M.intracellulareも含まれていた。一方、一般細菌はn-PCRでは増幅されなかった。3)PCR生成物の塩基配列は、結核菌群に属する7菌株では同一であった。非定型抗酸菌株は結核菌と比較して塩基配列レベルで73%から90%の相同性を有していた。4)PCR生成物のRFLP解析では、7種類の制限酵素を用いることによりn-PCRで増幅され得る結核菌群および11菌種の非定型抗酸菌の区別が可能であった。また、SmaIとNaeIの両者で切断されるのは結核菌群のみであった。5)細菌学的検査との結果の比較では、治療中の肺結核患者の喀痰におけるn-PCR法の陽性率は、67.2%であり、塗抹・培養法における陽性率41.8%より、有意に高率であった。これらの患者を細菌学的検査により2群に分けると細菌学的検査陽性例28例中26例(92.9%)、細菌学的検査陰性例39例中19例(48.7%)が、n-PCRで陽性であった。【結論】この方法は、アイソトープも不要であり、2日間で臨床検体中の抗酸菌の同定および菌種鑑別が可能であることから、臨床応用の可能性が示唆された。

[Objective] To explore the usefulness of nested PCR(n-PCR) in the field of acid-fast bacteria dnaJ sequencing and rapid diagnosis of acid-fast bacteria infections. In addition, PCR product gene alignment determination, restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis, species identification, and whether to investigate. [Results] 1)N-PCR detection limit: 1. DNA quantity: 10fg; 2. Mycobacterium tuberculosis cell quantity: 10 fg; 2)The DNA of 11 of the 16 non-typeable acid-resistant strains in the genus tuberculosis was increased. These non-stereotyped acid-fast bacteria include M.kansasii, M.avium and M.intracellulare. One side, general bacteria n-PCR 3)PCR products were sequenced and identified by 7 strains belonging to the genus Mycobacterium tuberculosis. The unclassified acid-resistant strains were 73% to 90% identical to each other. 4) RFLP analysis of PCR products showed that 7 kinds of restriction enzymes could be used in the amplification of n-PCR products, and it was possible to distinguish between TB bacteria and 11 kinds of non-typed acid-fast bacteria.また、SmaIとNaeIの両者で切断されるのは结核菌群のみであった。5)The comparison of bacteriological examination results showed that the positive rate of n-PCR method was 67.2% in sputum of tuberculosis patients under treatment, and 41.8% in smear culture method, which was intentionally high. 26 out of 28 bacteriological positive cases (92.9%), 19 out of 39 bacteriological negative cases (48.7%), and n-PCR positive cases. [Conclusion] This method can be used to identify the acid-resistant bacteria in clinical specimens.

项目成果

K.INYAKU, K.HIYAMA, S.ISHIOKA, T.INAMIZU and M.YAMAKIDO: "Rapid Detection and ldentification of Mycobacteria in Sputum Samples by Nested Polymerase Chain Reaction and Rastriction Fragment Length Polymorphisms of dnaJ Heat Shock Protein Gene" Hiroshima Jou

K.INYAKU、K.HIYAMA、S.ISHIOKA、T.INAMIZU 和 M.YAMAKIDO：“通过嵌套聚合酶链反应和 dnaJ 热休克蛋白基因的限制片段长度多态性快速检测和鉴定痰样本中的分枝杆菌” Hiroshima Jou