メチルコバラミンを供与体とする新しいメチル化酵素の構造と反応機構に関する研究

放線菌の生産する生理活性物質ビアラホス及びホスホマイシンの生合成経路に含まれる従来のメチル化酵素とは全く異なるメチルコバラミンを直接のメチル供与体とする2種の酵素(ビアラホスのP-メチラーゼ、ホスホマイシンのC-メチラーゼ)の構造と機能を明らかにすることを目的として研究を行ない以下の様な成果を得た。1.両酵素について遺伝子のクローン化及び塩基配列の決定を行ない、両者のアミノ酸配列の間に相同性があることを見出した。これにより両者の反応機構がメチルコバラミンをメチル供与体とする点において類似しているという申請者の仮説が強く支持された。2.両メチル化酵素とも無細胞系での活性は微弱であるので、メチルコバラミンの^<14>C-メチル標識体を調製し、高感度な活性の検出方法を検討した。その結果、極めて高感度な検出が可能であることが判明した。3.P-メチル化酵素遺伝子について大腸菌での高発現を試みた。本酵素遺伝子をヒスチジンヘキサマータグを有する組換え蛋白質を発現させるベクターに連結し、大腸菌での発現を検討したところ高発現が認められた。この組換え蛋白質はアフィニティーカラムを用いて一段階で精製することが可能である。しかしながら組換え蛋白質の大部分は不溶化しているため、今後はそれを活性のある状態に戻すことが重要な課題である。

放線菌の生産する生理活性物質ビアラホス及びホスホマイシンの生合成経路に含まれる従来のメチル化酵素とは全く異なるメチルコバラミンを直接のメチル供与体とする2種の酵素(ビアラホスのP-メチラーゼ、ホスホマイシンのC-メチラーゼ)の構造と機能を明らかにすることを目的として研究を行ない以下の様な成果を得た。1.両酵素について遺伝子のクローン化及び塩基配列の決定を行ない、両者のアミノ酸配列の間に相同性があることを見出した。これにより両者の反応機構がメチルコバラミンをメチル供与体とする点において類似しているという申請者の仮説が強く支持された。2.両メチル化酵素とも無細胞系での活性は微弱であるので、メチルコバラミンの^<14>C-メチル標識体を調製し、高感度な活性の検出方法を検討した。その結果、極めて高感度な検出が可能であることが判明した。3.P-メチル化酵素遺伝子について大腸菌での高発現を試みた。本酵素遺伝子をヒスチジンヘキサマータグを有する組換え蛋白質を発現させるベクターに連結し、大腸菌での発現を検討したところ高発現が認められた。この組換え蛋白質はアフィニティーカラムを用いて一段階で精製することが可能である。しかしながら組換え蛋白質の大部分は不溶化しているため、今後はそれを活性のある状態に戻すことが重要な課題である。