新しいエポキシ化反応を解媒する酵素の構造と反応機構に関する研究

催化新型环氧化反应的酶结构及反应机理研究

• 批准号: 07660132
• 负责人: 日高 智美
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660132/
• 关键词: ホスホマイシン; エポキシド; エポキシ化酵素

申請者は放線菌の生産する抗生物質ホスホマイシンの生合成研究の過程で、ホスホマイシンのエポキシドが2級アルコール(ヒドロキシプロピルホスホン酸)の脱水素により生ずる新しいタイプのエポキシ化反応であることを見い出した。このホスホマイシンのエポキシ化酵素の精製、構造と反応機構の解明を目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.ホスホマイシンを生産する放線菌Streptomyces wedmorensisより本酵素遺伝子をクローン化し、塩基配列を決定した。塩基配列より推定されるアミノ酸配列から本酵素は耐熱菌のアルコール脱水素酵素(NADP依存型)と低い相同性を有するとこが明らかとなった。さらに、大腸菌での本酵素の大量発現を検討しlacプロモーターを利用した大量発現に成功した。2.上記大腸菌酵素の活性測定の至適条件、安定化条件を検討し、精製を行った。イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過HPLCなどにより均一な精製に成功し、本酵素はサブユニット分子量26kDaの3量体であることが判明した。3.精製酵素を用いて生化学的諸性質、反応機構の検討を行った。その結果、反応至適温度は37℃、至適pHは7.0、基質であるヒドロキシプロピルホスホン酸に対するKm地は0.24mMであった。また、反応機構の検討の結果、このエポキシ化反応は好気条件で進行すること、反応には2価の鉄イオンが必須であること、反応の結果過酸化水素が生成することが明らかとなった。従って、本酵素は2価の鉄イオンを補因子とする酸化還元反応であることが判明した。

Applicants は actinomycetes の production す る antibiotic substances ホ ス ホ マ イ シ ン の で の biosynthesis research process, ホ ス ホ マ イ シ ン の エ ポ キ シ ド が level 2 ア ル コ ー ル (ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル ホ ス ホ ン acid) の dehydrated vegetable に よ り raw ず る new し い タ イ プ の エ ポ キ シ turn against 応 で あ る こ と を see い out し た. こ の ホ ス ホ マ イ シ ン の エ ポ キ シ phenoloxidase の refined, tectonic と の 応 authorities interpret を purpose と し を い, the following の て research を た. 1. ホ ス ホ マ イ シ ン を production す る actinomycetes Streptomyces wedmorensis よ り traces of this enzyme 伝 son を ク ロ ー ン し, salt base with column を decided し た. Salt column base with よ り presumption さ れ る ア ミ ノ acid with column か ら this enzyme は heat-resisting fungus の ア ル コ ー ル dehydrated vegetable enzyme (NADP dependent type) と low い identity を have す る と こ が Ming ら か と な っ た. さ ら に, coliform で の this enzyme の large 発 presently を beg し 検 lac プ ロ モ ー タ ー を using し た large 発 に success now し た. 2. The determination of the enzyme activity of escherichia coli is carried out to the appropriate conditions, the stabilization conditions are を検 to be discussed, and the refinement is を to be carried out った. イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, water 疎 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, ゲ ル filtration HPLC な ど に よ り uniform な refined に し success, this enzyme は サ ブ ユ ニ ッ ト molecular weight 26 kda の 3 quantity body で あ る こ と が.at し た. 3. The refined enzyme を uses the various biochemical properties and anti応 mechanisms of を 検 to discuss を and った. は そ の result, anti 応 to optimum temperature of 37 ℃, to 7.0, the optimum pH は matrix で あ る ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル ホ ス ホ ン acid に す seaborne る Km to は 0.24 mM で あ っ た. Beg の ま た 応 institutions and anti の 検 results, こ の エ ポ キ シ turn against 応 は good 気 condition で す る こ と, anti 応 に は 2 価 の iron objects イ オ ン が must で あ る こ と, anti 応 の water acidification passes the result element が generated す る こ と が Ming ら か と な っ た. Youdaoplaceholder0, this enzyme 価 2価 <s:1> iron <s:1> を を supplement factor とする acidification reductant 応である とが とが determine た.

项目成果

HIDAKA,T.: "Sefucna of a P-methyltransferase-encoding gene isolated from a bialaphos-producing Streptomyas hygroscopicus." Gene. 158. 149-150 (1994)

HIDAKA,T.：“从产双丙磷的吸水链霉菌中分离出 P-甲基转移酶编码基因的 Sefucna。”

KUZUYAMA,T.: "Nacleotide seguence of fortimicin KLI mathyltransferase gene of Micromorospera" J.Antibiot.48. in press (1995)

KUZUYAMA，T.：“Micromorospera 的福替米星 KLI 甲基转移酶基因的核苷酸序列”J.Antibiot.48。

HIDAKA,T.: "Cloning and nucleotide Seguence of fosfomycin biosynthetic genes of Streptomyces wedmarensis." Mol.Gen.Genet.249. 274-280 (1995)

HIDAKA,T.：“韦德马链霉菌磷霉素生物合成基因的克隆和核苷酸序列。”