凍結割断レプリカを用いた免疫染色による肝細胞ギャップ結合の電子顕微鏡観察

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我々は、細胞膜の真表面(細胞外ならびに細胞質側表面)の巨分子構造を観察するための方法としてfracture-flipあるいはfracture-flip/Triton法を開発し、種々の細胞や細胞内小器官の膜表面の構造を報告した。一連の研究から、凍結割断で露出、カーボン蒸着されたmembrane halfは物理的に安定しており、Tritonのような界面活性剤では可溶化されないこと、細胞膜内の蛋白質の免疫原性や酵素活性のような生物学的活性の保持に優れていることが明らかになった。この結果から、我々は以下の手順によって、少なくとも、p-面に露出されたギャップ結合の膜内粒子(コネクソン)をコネクシン(Cx)抗体によって免疫染色することが理論的には可能であると考えた:1.試料を急速凍結、2.常法に従い凍結割断ならびに白金ーカーボン蒸着を行なう、3.Triton-100あるいはSDS等の界面活性剤で凍結割断されていない形質膜と細胞質を可溶化した後に、露出したコネクソンの細胞質側を抗体で免疫染色する。本申請研究においては、実際の手技と、肝細胞形質膜上におけるギャップ結合構成蛋白質コネクシンの免疫局在を検討した。〔方法〕マウス肝の未固定、未凍結切片をBalzers社製双面レプリカ用試料台に圧着、液体窒素で凍結し、常法に従って、凍結割断ならびに白金とカーボン蒸着を行なった。レプリカを2.5%Triton X-100あるいはSDSで12時間処理後、Cx32と26に対する抗体(愛媛大学島津孝教授と九州大学柴田洋三郎教授より提供)を用いて、免疫コロイド金標識を行なった。ギャップ結合のCx32と26の構成比がギャップ結合プラークの大きさによって異なること、ギャップ結合以外の形質膜にもCxが存在していることが明らかになった。