蛍光標識プライマーを用いたPCR法によるDNA多型解析

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FAXとHEXの蛍光色素をMCT118プライマーの5′末端にそれぞれ標識し、PCRの増幅を行った。用いたDNA試料はすでにアリル決定されたものであり、16〜35アリルまでの増幅を試み、アレリックラダーマーカーを作製した。またRoxでラベルしたスタンダードを用いて、DNAシークエンスゲル泳動を行い、GENESCANソフトで解析したところ、600bp以下ではほぼ正確な塩基数が測定された。しかし600〜800bpのアリルは3〜8bpの誤差が認められるが、アリル間の塩基数の差は16bpであることから、アリル決定には問題はない。次に同一試料でFAM標識とHEX標識の泳動差を検討した。その結果1bp以下の誤差であることからラダーマーカーを用いた未知検体の型判定には極めて有効であることが証明された。STRシステムのSE33の増幅にもFAMとHEXをそれぞれ5′末端に標識したプライマーを用いた。MCT118システムと同様にアレリックラダーを作製し、検体試料をHEXで標識し型判定を行った。2色の蛍光標識による型判定は極めて正確に出来ることが判明した。また銀染色によるバンドの検出よりもはるかに検出感度が高くDNAとして100bgの量まで検出可能であった。