領域置換で作成したキメラH^+ポンプの構造形成と光H^+ポンプ機構の解析

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1.アーキオプシン(aO)のヘリックスEとFをつなぐループ領域(ループEF)に5アミノ酸の欠失を与えた変異体△(A165-R169)と△(G170-A174)では、in vitroのクロモホア形成の速度と収率は、野生型aOの10%と40%となった。50%クロモホア形成に必要なDMPC量は野生型では100モル/モルaOであったのに対し、欠失変異体では1600モル/モル△aOであった。これらの欠失変異体は光照射で不可逆的に退色したので、光化学反応の解析は困難であった。一方、2アミノ酸の欠失を与えた変異体は野生型とほとんど同じであった。2.ループEFのP171とE172間に2アミノ酸(EE)と5アミノ酸(EVGSE)の挿入を与えた変異aOでは、in vitro のクロモホア形成の速度と収率が、それぞれ、野生型の35%と60%となった。50%クロモホア形成に必要なDMPC量は1000モル/モルaOであった。これらの挿入変異体の光サイクルはN様中間体の寿命が伸び(数秒)、細胞質側からのH^+取り込み(Asp102の再プロトン化)速度が低下した。3.ループEFのE168とE172をArgに置換して負電荷を無くした変異体とK167とR169をGluに置換して負電荷を増やした変異体は、野生型とほぼ同じ速度でクロモホアを形成したが、収率は80%程度になった。これらの変異体の光サイクルは野生型とほとんど同じであった。4.以上の結果から、(i)ループEFの長さが7本のヘリックスの適切なパッキングに重要な役割を持つこと、(ii)負電荷への置換ではなく、負電荷の挿入によってAsp102の再フロトン化速度が遅くなることが解った。今後、H^+取り込み口の構造についての考察を加えて、得られた成果を公表する予定である。