生体イオンポンプの反応中間体のX線結晶構造解析

生物离子泵反应中间体的X射线晶体结构分析

• 批准号: 12480199
• 负责人: 神山 勉
• 金额: $ 5.89万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12480199/
• 关键词: X線結晶構造解析; 膜蛋白質; バクテリオロドプシン; アーキロドプシン; 光駆動プロトン輸送; 蛋白質の結晶化; 生体膜; 反応中間体; 膜蛋白質の結晶化; 脂質-蛋白質間相互作用; シンクロトロン放射光

光駆動プロトンポンプとして知られるバクテリオロドプシンの反応中間体の立体構造を求めることを目指して研究を行った。これまでに、膜融合を利用して膜蛋白質を結晶化することを試み、脂質分子を含んだバクテリオロドプシンの三次元結晶を作成する技術の開発を行ってきたが、本研究においては、この結晶化法を改良し、構造解析の分解能を2.3オングストロームまで向上させた。これにより、蛋白質に結合した脂質の構造および活性部位の水分子の位置を求めることができた。また、バクテリオロドプシンの反応中間体の構造解析を行うため、単結晶のX線回折と吸収スペクトルの同時測定を行うための装置も作成し、低温下での光照射により結晶中に蓄積した中間体の量を高精度で求める方法を確立した。このような開発研究を積み重ねる中で、蛋白質結晶のX線損傷が従来考えられてきたより遥かに少量のX線照射量により引き起こされることを見出した。この結果を踏まえ、X線損傷の影響を軽減できる低温X線回折測定法を開発し、反応サイクルの初期に現れるK中間体についての信頼度の高い回折データを得た。構造解析の結果、反応サイクル初期に引き起こさせる構造変化は発色段レチナールのシッフ塩基近傍に限定されることが示された。また、反応サイクルの後半に現れるM中間体についても構造解析の精度を高め、蛋白質を構成する7本のヘリックスのうち一本(Gヘリックス)が膜面に垂直方向にスライドすることを確認するとともに、活性部位における水分子の動きも明らかにした。さらに、K中間体が熱緩和して生じるL中間体についても構造解析を行い、構造変化の認められる領域が細胞外側方向に広がることを明らかにした。また、バクテリオロドプシンと類似の蛋白質であるアーキロドプシンの結晶化を行い、4オングストロームの分解能の回折データを収集した。まだ解析途上であるが、アーキロドプシン4量体が集積して結晶ができていることが示唆されている。

A study on the stereostructure of photoactive intermediates was carried out. In this study, the crystallization method of membrane fusion protein was improved, and the decomposition energy of structural analysis was improved. The structure of lipid and the position of water molecule in active site are determined by protein binding. A method for determining the amount of intermediate accumulated in crystals with high accuracy by X-ray reflection and absorption of crystals at low temperature was established. The X-ray damage of protein crystals was found in the study of the development of the disease. The results showed that the influence of X-ray damage was reduced, and the development of low-temperature X-ray reflection assay was achieved. The results of structural analysis, the initial introduction of structural transformation, the development of color segment, the close proximity of structural transformation, and the development of structural transformation. In the second half of the reaction, the intermediate structure analysis accuracy is high, the protein composition is high, the membrane surface vertical direction is high, the active site is high, the water molecule movement is high. In addition, K intermediates are thermally relaxed, L intermediates are structurally analyzed, and structural transformation is recognized. The crystallization of protein, the decomposition of protein, and the synthesis of protein. In the analysis, the four quantities are aggregated and crystallized.

项目成果

S.Yamamoto, et al.: "Ab initio MO study on the potential energy surfaces for twisting around C15=N bond of protonated Schiffbase of retinal"THEOCHEM. 543. 79-87 (2001)

S.Yamamoto 等人：“从头开始 MO 研究围绕视网膜质子化希夫碱 C15=N 键扭转的势能表面”THEOCHEM。

T.Kimura, et al.: "Theory of excitation energy transfer in the intermediate coupling case. II.Criterion for intermediate coupling excitation energy transfer mechanism and application to the photosynthetic antenna system"J.Phys.Chem.B. 104. 9276-9287 (2000

T.Kimura等人：“中间耦合情况下的激励能量转移理论。II.中间耦合激励能量转移机制的判据及其在光合天线系统中的应用”J.Phys.Chem.B.

S.-Y.Park, et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Analysis of a Cytochrome P450 (CYP119) from Sulfolobus solfataricus"Acta Cryst. D56. 1173-1175 (2000)

S.-Y.Park 等人：“来自硫磺硫化叶菌的细胞色素 P450 (CYP119) 的结晶和初步 X 射线衍射分析”Acta Cryst。

T.Kawatsu, et al.: "Worm Model for Electron Tunneling in Proteins : Consolidation of the Pathway Model and the Dutton Plot"J.Phys.Chem.B,. 105. 4424-4435 (2001)

T.Kawatsu 等人：“蛋白质中电子隧道的蠕虫模型：路径模型和达顿图的巩固”J.Phys.Chem.B,。

T.Hishiki, et al.: "X-Ray Crystal Structure and Catalytic Properties of Thr252lle Mutant of Cytochrome P450cam : Roles of Thr252 and Water in the Active Center"J.Biochem.. 128. 965-974 (2000)

T.Hishiki等人：“细胞色素P450cam的Thr252lle突变体的X射线晶体结构和催化特性：Thr252和水在活性中心中的作用”J.Biochem..128.965-974(2000)