Live-cell single-molecule investigation of localization and fate of m6A-modified mRNA

m6A 修饰 mRNA 的定位和命运的活细胞单分子研究

基本信息

项目摘要

Post-transcriptional RNA modifications are crucial for cell viability. Today over 170 posttranscriptional RNA modifications in protein coding as well as non-coding RNA are known. One such RNA modification is methylation on the sixth position of the purine ring of adenine in both mRNA (N6-methyladenosine, m6A) and non-coding RNA. m6A represents the most abundant internal mRNA modification in eukaryotes. Its importance is highlighted by the fact that m6A modification is crucial for many aspects of mRNA metabolism from birth to death that includes nuclear pre mRNA processing, cytosolic export of mRNA, mRNA translation, mRNA decay and interaction with RNA granule. RNA sequencing studies discovered that m6A modifications are highly enriched near stop codons and in 3’ untranslated regions (3’ UTR) of mRNAs. The 3’ UTR influences mRNA stability, translation efficiency, and its subcellular localization. One example of biologically important and functional methylation target 3’ UTR is given by the sex determining region y-box 2 (SOX2) mRNA which encodes for a key transcription factor and represents an oncogene. Its methylation status substantially shapes the fate of mRNA and viability of cells, respectively. However, a number of fundamental questions with respect to 3’ UTR m6A modified mRNAs and its influence on translation efficiency, kinetic and ribosome load, and RNA granules interactions are still unanswered. Utilizing 3’ UTR of SOX2 mRNA as model m6A system, a combination of cutting-edge microinjection‐based single-molecule RNA tracking methods, mRNA translation visualization techniques, and ultrahigh-resolution live cell-based single molecule fluorescence microscopy the objective of this project is to characterize the influence of 3’ UTR methylation in mRNA with respect to translation efficiency, translation kinetics, and partitioning kinetics into RNA granules (P bodies/stress granules) as well as its enrichment in RNA granules under normal and stress conditions. All this will provide unprecedented insights into understanding of m6A modification in mRNA and open a novel perspective and concept on the dynamics of the gene regulation processes collectively referred to as epitranscriptomics.
转录后RNA修饰对细胞活力至关重要。目前已知有170多种蛋白质编码和非编码RNA转录后RNA修饰。一种这样的RNA修饰是在mRNA(N6-甲基腺苷,m6A)和非编码RNA中腺嘌呤嘌呤环的第六位上的甲基化。M6A代表了真核生物中最丰富的内部mRNA修饰。M6A修饰对从出生到死亡的mRNA代谢的许多方面都是至关重要的,这一事实突显了m6A的重要性,这些方面包括核前mRNA加工、胞质mRNA输出、mRNA翻译、mRNA衰变以及与RNA颗粒的相互作用。RNA测序研究发现,m6A修饰在mRNAs的终止密码子附近和3‘非翻译区(3’UTR)高度丰富。3‘端非编码区影响信使核糖核酸的稳定性、翻译效率及其亚细胞定位。性别决定区域y-box 2(SOX2)是一个具有重要生物学意义和功能的甲基化靶标3‘UTR的例子,它编码一个关键的转录因子,代表一个癌基因。它的甲基化状态在很大程度上决定了mRNA的命运和细胞的生存能力。然而,关于3‘UTRm6A修饰的mRNAs及其对翻译效率、动力学和核糖体负载以及RNA颗粒相互作用的影响等一些基本问题仍然没有答案。本研究以SOX2基因3‘端非编码区为模型M6A系统,结合基于显微注射的单分子RNA跟踪技术、mRNA翻译可视化技术和基于超高分辨率活细胞的单分子荧光显微镜技术,研究在正常和应激条件下,3’端非编码区甲基化对翻译效率、翻译动力学和分配到RNA颗粒(P小体/应激颗粒)的影响,以及其在RNA颗粒中的富集性。所有这些都将为理解m6A在mRNA中的修饰提供前所未有的见解,并为统称为表位转录组学的基因调控过程的动力学打开一个新的视角和概念。

项目成果

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Dr. Andreas Schmidt, Ph.D.其他文献

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