Structural and mechanistic study of C-N bond forming cytochrome P450 enzyme

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TleBは放線菌由来の天然物テレオシジンの生合成酵素である。TleBは直接酸化型C-N結合形成反応を触媒する珍しいシトクロムP450酵素であり、生体触媒としての応用が期待される。TleBの反応機構を調べるため、野生型酵素の X線結晶を入手し、その情報をもとに活性中心のアミノ酸残基に変異を導入した変異体酵素を作成した。野生型酵素と変異体酵素の活性を比較し、触媒活性に必須のアミノ酸残基を同定した。同時に、TleBの反応中間体を捉えるため、C-N結合を形成する窒素を酸素、または硫黄に置換した非天然型気質をデザイン,合成した。非天然型基質とTleB酵素の共結晶構造解析から、非天然型基質はTleBの活性中心で天然基質と同様な相互作用を持つことを確認した。この結果から、非天然型基質の反応機構は、天然型の反応機構に関連があることが示唆された。非天然型気質を用いた酵素反応から反応産物を単離し、構造決定を行った。窒素を酸素に置換した非天然型基質から得られた酵素反応産物は三環式構造を有し、エポキシド中間体を介したメカニズムで形成されると考察した。更に、窒素を硫黄に置換した非天然型基質を用いた反応では、C-S結合が形成されることを確認した。本研究により、TleBは様々な気質を受け入れること、また基質の構造により、元来とは異なる結合を作成できることを証明した。本研究で得られた非天然型反応産物はどれも新規化合物であり、現在これらの生物活性を調べている。また、TleBの基質許容性を把握するため、その他の基質も合成している。