アルテミシニン耐性原虫封じ込めを可能にするin vitro迅速定量検査法の開発

开发一种能够抑制青蒿素抗性原生动物的体外快速定量检测方法

• 批准号: 18H06149
• 负责人: 池田 美恵
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-08-24 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06149/
• 关键词: アルテミシニン; 核蛍光; ミトコンドリア蛍光; FACS; RSA; 死原虫; アルテミシニン耐性; 熱帯熱マラリア原虫; Pyknotic; 定量検査

本年度は、ウガンダのマラリア感染患者から得た凍結血液検体からの培養株樹立およびマラリア原虫生死判定法の検討を実施した。凍結血液検体は、12% NaCl溶液および1.6% NaCl溶液を用いて解凍した。薄層ギムザ染色標本によって原虫の増殖を確認、原虫感染率1%以上での継代培養が3回以上となった時点で、限界希釈法によってクローン化を実施した。また、ウガンダのアルテミシニン(ART)耐性原虫も同様に解凍し、培養を実施した。耐性原虫はKelch13遺伝子に変異を持っている。この変異をマーカーとして継代中の原虫を確認したところ、ART耐性原虫が減少していくことが分かった。ARTを添加した培養系を用いて耐性原虫のみを得る必要があり、そのための培養系を現在検討している。マラリア原虫生死判定のために、ミトコンドリア蛍光(Mitotracker Red CMXRos）と核蛍光(SYBR Green I)をマーカーとして、Fluorescence activated-cell sorting（FACS)による測定条件の検討を行った。それぞれの蛍光試薬の希釈系列を作成し、非感染赤血球と感染赤血球の測定値の差が最も大きい濃度を最適濃度と設定した。検討の結果、ミトコンドリアでは12.5nM、核では0.0125xの濃度が最適濃度となった。この濃度の有効性をRSAサンプルの生存原虫測定によって検証したところ、FACSでの生存原虫検出率がギムザ染色の1/8-1/16倍であり、FACSの検出率が低かった。原虫のミトコンドリアは発達段階によってサイズが異なり、特に感染初期のearly ring-formではミトコンドリアを十分に染色出来ない可能性が考えられる。ミトコンドリアでの染色条件の検討を続けるとともに死原虫(Pyknotic)核のみをDAPIで検出する方法も検討している。

This year, we have established a method for determining the life and death of protozoa by using frozen blood samples from patients infected with the disease. Freeze the blood body, use the 12% NaCl solution, and use the 1.6% NaCl solution to thaw. The proliferation of protozoa can be confirmed by thin-layer ギムザ staining specimens, and the protozoal infection rate is more than 1%. Cultivate the となったtime point で for more than 3 times, and limit the limit of the によってクローン化を実事した.また, ウガンダのアルテミシニン (ART) resistant protozoa も同様にthawingし, culture を実时した. Resistant protozoa はKelch13 缝子に変different をhold っている.この変different をマーカーとして継継中の protozoa をconfirmation したところ, ART-resistant protozoa がreduce していくことが分かった. ARTをAdd the culture system of した and use the いて-resistant protozoa のみをget the necessary があり, and the そのためのculture system をNow check the している.マラリア protozoa life and death judgment のために, ミトコンドリア蛍光 (Mitotracker Red CMXRos) とnuclear worm light (SYBR Green I) をマーカーとして, Fluorescence activated-cell sorting (FACS) and measurement conditions. The それぞれの蛍光 trial 薬の西釈 series is made, and the measurement of non-infected erythrocytes and infected erythrocytes is the maximum concentration and the optimal concentration is set. The results of 検椳ンドリアでは12.5nM, the optimal concentration of core では0.0125xのconcentrationとなった. Effectiveness of the concentration of RSA, survival protozoa test, FACS test The survival rate of protozoa is 1/8-1/16 times that of dyeing, and the rate of FACS is low. Protozoal parasites, early stages of infection The possibility of dyeing the ring-form is very high.ミトコンドリアでの staining conditions の検を続けるとともに Death protozoa (Pyknotic) nucleus のみをDAPI で検出する method も検している.

项目成果

ウガンダ北部マラリア原虫集団におけるアルテミシニン耐性レベルの推移

乌干达北部疟原虫种群青蒿素耐药性水平的变化

• 发表时间: 2019
• 作者: 池田 美恵 ;金子 恵 ;橘 真一郎 ;山内 祐人 ;バリカガラ ベティ;江本 桜子 ;福田 直到 ;牧 喜子;森 稔幸 ;平井 誠 ;橋本 宗明 ;カツロ オスベルト ;アウマ マリー;アニワー デニス ;バラクパック ニリアン;片岡 正俊;アギニア エマニュエル;木村 英作;堀井 俊宏 ;美田 敏宏.
• 通讯作者: 美田 敏宏.