線維性異形成症における感受性遺伝子の探索とクリスパー技術を用いた骨分化機構の解明

利用CRISPR技术寻找纤维异常增生的易感基因并阐明骨分化机制

• 批准号: 21K21015
• 负责人: 安藤 和代
• 金额: $ 2万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-08-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K21015/
• 关键词: Cecr2; CRISPR/Cas9; hBMSCs; Fibrous dysplasia; RNA -seq; Chipーseq; 骨分化誘導; G タンパク共役型受容体; 間葉系幹細胞; GPCR

当初の予定では、CRISPR/Cas9 技術を用いて、hBMSCs のCecr2 遺伝子をノックアウトした細胞株（Cecr2 KO hBMSCs）を樹立。Cecr2 のWTとCecr 2 KO hBMSCs 細胞を用いて、骨分化誘導を行い、骨代謝マーカー (アルカリフォスファターゼ (ALP)、Bone Sialo protein (BSP) など) の発現レベルについて現有の定量PCRおよび定量Western blot解析を行い、さらに、ALP活性およびCa量の定量評価及びアリザリンレッド染色法を用いた石灰化能の検討を行い、さらに骨分化誘導後のCecr2 WTとKO hBMSCs 細胞を用いて、RNA-seq によって骨分化に関連する遺伝子の発現変動を網羅的な解析、また同条件下で、Cecr2 WTとKO hBMSCs のクロマチン免疫沈降シークエンス（ChIP-seq）を行い、その結果から、アセチル化された骨分化関連遺伝子のプロモーターあるいはエンハンサー領域において、どの部位に Cecr2 が結合しているか解析し、Cecr2 により制御される骨分化関連遺伝子の同定及び、Cecr2 KOがアセチル化領域全体の増減に影響するかも解析する予定であったが、産休育休取得のため、ノックアウト細胞株の作成まで行っている状況である。

最初的计划是建立使用CRISPR/CAS9技术在HBMSC中淘汰CECR2基因的细胞系（CECR2 KO HBMSC）。我们使用CECR2 WT和CECR 2 KO HBMSCS细胞来诱导骨分化，我们进行了现有的定量PCR和定量蛋白质印迹分析，用于骨代谢标记的表达水平（碱性磷酸酶（ALP）（ALP），唾液蛋白（BSP）等），并使用Alp活性和ca catiz contiz contranciz contranting Alp Allp Alding contred contranting contrancin和CACERIANS REDINED cANTINE CANTIS，并进行了can iniz contred contred和CARENTINE CAN REDINED。我们还使用骨分化诱导后使用CECR2 WT和KO HBMSCS细胞，以全面分析与骨分化相关的基因的表达变化，在相同条件下，CECR2 WT和KO HBMSC染色质蛋白染色质蛋白染色质蛋白免疫沉淀测序（CHIP-SESEQ）的启动和分析的启动者或分析的启动者或分析的启动者或分析。乙酰化OSSE分化相关的基因，并鉴定由CECR2调节的Ossection相关基因，并分析CECR2 KO是否会影响整个乙酰化区域的增加或减少，但是为了捕获产假假，已经产生了基因敲除细胞系。