膵液糖タンパク質GP2のN型糖鎖と細菌レクチンFimHとの構造-親和性相関

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腸管は、私達が摂取した食べ物や侵入してきたウイルスや病原菌、さらに約100兆個にもなる腸内細菌に常に曝されている。多数の腸内細菌が生息している大腸は、厚い2層のムチン層による粘膜バリアをもち、腸管の恒常性を維持している。しかし、栄養不良などによる粘膜バリアの菲薄化は、腸内細菌の腸上皮細胞表面への定着を引き起こし、炎症性腸疾患の原因となりうる。GP2は、大腸が持つ炎症を抑制的に制御する仕組みの一つである。GP2は膵臓で合成される糖タンパク質で、腸管管腔へ移行したのち腸内細菌の線毛タンパク質FimHに結合し定着を阻害する。本研究では、腸管管腔における細菌認識機構について、GP2とFimHとの結合におけるタンパク質および糖鎖レベルでの構造活性相関を明らかにする。研究計画初年度となる今年度は、マウスGP2のFimH結合ドメイン（D10Cドメイン）を哺乳類細胞で発現・精製するためのコンストラクトを構築した。発現コンストラクトをHEK293T細胞に導入し、培養上清への分泌を確認した。さらに、N結合型糖鎖付加部位に変異を導入したコンストラクトを作製し、同様に発現・分泌を確認した。分泌した組換えGP2タンパク質を部分精製し、糖鎖切断酵素による糖鎖構造の解析を行った。その結果、組換えGP2にはFimHが認識すると予想される構造の糖鎖がほとんどないことが明らかになった。また、大腸菌FimHのGP2結合レクチンドメインを発現するためのコンストラクトを構築し、大腸菌への形質転換後、ペリプラズムへの分泌発現を確認した。組換えFimHタンパク質を部分精製し、バイレイヤー干渉法（BLI）による糖タンパク質との相互作用解析系を立ち上げた。