ミトコンドリアユビキチン修飾シグナルのシステム解明

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MITOLによるユビキチン修飾の生理的役割の解明として、新規基質HMOX2の修飾について解析を行った。脱ユビキチン化アッセイの結果、MITOLによってHMOX2へ付加されるポリユビキチン鎖はプロテアソーム分解に働くK48結合型ではなく、活性制御に働くK63結合型であった。また、HMOX2におけるユビキチン化されるリジン残基を同定するべく、26箇所全てのリジンを1箇所ずつアルギニンに置換した変異体を作製し、各変異体の修飾を検討した。その結果、MITOLによるユビキチン化が顕著に減少する変異体を見出した。MITOLの基質に対するユビキチン鎖決定機構の解明として、新規結合分子OTUD4について解析を行った。OTUD4は通常K48結合型のユビキチン鎖を切断するが、リン酸化されることでK63結合型を切断するようになるユニークな脱ユビキチン化酵素である。以前より所属の研究室にて解析を進めてきたParkinは、MITOLによってCCCP刺激時にK48結合型、Rotenone刺激時にK63結合型のユビキチン鎖が付加される。同様の刺激条件下において、OTUD4のリン酸化をPhos-tag PAGEにより検出したところ、CCCP刺激時にのみリン酸化されることを見出した。したがって、Parkinのユビキチン鎖の種類はMITOLではなく、OTUD4によって決定されていることが示唆された。MITOLのユビキチン化基質の新規スクリーニング法の構築のために、AID2システムを導入したHeLa細胞を樹立した。OsTIR1安定発現細胞においてCRISPR-Cas9法を用い、ゲノム上のMITOL遺伝子のエキソン１領域にmAIDタグ配列をノックインした。5-Ph-IAA処理後、3時間以内に内在性MITOLが消失することをウエスタンブロッティングにより確認できた。