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ミトコンドリアユビキチン修飾シグナルのシステム解明

线粒体泛素修饰信号系统的阐明

基本信息

批准号：
22K20637
负责人：
伊藤直樹
金额：
$ 1.83万
依托单位：
Gakushuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

MITOLによるユビキチン修飾の生理的役割の解明として、新規基質HMOX2の修飾について解析を行った。脱ユビキチン化アッセイの結果、MITOLによってHMOX2へ付加されるポリユビキチン鎖はプロテアソーム分解に働くK48結合型ではなく、活性制御に働くK63結合型であった。また、HMOX2におけるユビキチン化されるリジン残基を同定するべく、26箇所全てのリジンを1箇所ずつアルギニンに置換した変異体を作製し、各変異体の修飾を検討した。その結果、MITOLによるユビキチン化が顕著に減少する変異体を見出した。MITOLの基質に対するユビキチン鎖決定機構の解明として、新規結合分子OTUD4について解析を行った。OTUD4は通常K48結合型のユビキチン鎖を切断するが、リン酸化されることでK63結合型を切断するようになるユニークな脱ユビキチン化酵素である。以前より所属の研究室にて解析を進めてきたParkinは、MITOLによってCCCP刺激時にK48結合型、Rotenone刺激時にK63結合型のユビキチン鎖が付加される。同様の刺激条件下において、OTUD4のリン酸化をPhos-tag PAGEにより検出したところ、CCCP刺激時にのみリン酸化されることを見出した。したがって、Parkinのユビキチン鎖の種類はMITOLではなく、OTUD4によって決定されていることが示唆された。MITOLのユビキチン化基質の新規スクリーニング法の構築のために、AID2システムを導入したHeLa細胞を樹立した。OsTIR1安定発現細胞においてCRISPR-Cas9法を用い、ゲノム上のMITOL遺伝子のエキソン１領域にmAIDタグ配列をノックインした。5-Ph-IAA処理後、3時間以内に内在性MITOLが消失することをウエスタンブロッティングにより確認できた。

MITOL is a new substrate for HMOX2. The results of mitol and HMOX2 are as follows: MITOL and HMOX are as follows: mitol and HMOX are as follows HMOX2 is the first to be identified by a sequence of 26 residues, including 1 residue, and the second to be identified by a sequence of substitutions, and each variant modification is discussed. As a result, we have seen significant changes in the reduction of traffic in MITOL. The matrix of MITOL determines the resolution of the mechanism, and the new regulation binds to the molecular OTUD4. OTUD4 is normally K48-conjugated enzyme that switches off, acidifies and switches off K63-conjugated enzyme. The analysis of the previous research laboratory to which it belongs has been carried out in the following ways: K48 binding type when CCCP is stimulated by MITOL, K63 binding type when Rotenone is stimulated by CCCP. Under the same stimulation conditions, OTUD4 was detected by Phos-tag PAGE, and CCCP was detected by PCR. For example, if you want to change your mind, you can change your mind. A new method of constructing MITOL's matrix was introduced into HeLa cells. The CRISPR-Cas9 method is used in the stable development of OsTIR1 cells. After 5-Ph-IAA treatment, the intrinsic MITOL disappeared within 3 days.