胚盤胞補完法を用いた多能性幹細胞からの眼球再生

眼球は非常に複雑な組織構造を持つため従来の細胞レベルでの再生移植では限界があり、また眼球自体の再生は難しく世界で報告がない。本研究では眼球という複雑な実質臓器の三次元再生を目的とし世界で初めてそれを可能とする方法を見出した。将来的に大型動物での異種間胚盤胞補完法に応用しヒト自己多能性幹細胞（iPS細胞）由来の眼球角膜網膜全層再生を行い治療法のない失明を伴う多くの眼科疾患の新規治療を目的として本研究を行った。具体的には胚盤胞補完法の技術と眼球欠損マウスを組み合わせる方法を試みた。胚盤胞補完法とは特定臓器欠損動物の胚盤胞に正常iPS細胞を注入しキメラが成立すると欠損臓器がドナー由来に置換される。本研究ではまず眼球欠損マウスが必要で眼形成マスター遺伝子Pax6に着目した。Pax6は眼胞、水晶体、網膜、角膜に発現しPax6変異マウスはRx遺伝子の存在で前脳から眼胞が突出し頭部表皮外胚葉に接するが水晶体プラコードが誘導されず眼胞は退行変性する。本研究にはPax6ヘテロ変異マウス(B6EiC3Sn　a/A-Pax6Sey-Dey/J)を用いた。眼球摘出し遺伝子解析免疫組織学的解析等を行い、その後ヘテロ型どうしを掛け合わせ眼球欠損マウスの作製を試みた。その過程でヘテロ型は野生型と比較し低体重で成長不良、奇形や視力障害も伴い通常の雌雄勾配や妊娠出産が難しい可能性が生じ、体外受精による受精卵作製と仮親への移植の必要性が高まり、本研究計画においてその過程を追加した。ヘテロ型雄のマウスを、排卵誘発した同雌と交配し受精卵を作製した。一部中断しているが随時本研究を再開し、その後の計画としては、この作製受精卵を仮親子宮に移植後得られた胚盤胞にEGFP標識iPS細胞を注入しドナー由来眼球再生の確認と網膜電図による視機能解析や免疫染色による眼球組織構造解析、遺伝子発現解析を施行し眼球再生モデルを構築する。

眼球は非常に複雑な組織構造を持つため従来の細胞レベルでの再生移植では限界があり、また眼球自体の再生は難しく世界で報告がない。本研究では眼球という複雑な実質臓器の三次元再生を目的とし世界で初めてそれを可能とする方法を見出した。将来的に大型動物での異種間胚盤胞補完法に応用しヒト自己多能性幹細胞（iPS細胞）由来の眼球角膜網膜全層再生を行い治療法のない失明を伴う多くの眼科疾患の新規治療を目的として本研究を行った。具体的には胚盤胞補完法の技術と眼球欠損マウスを組み合わせる方法を試みた。胚盤胞補完法とは特定臓器欠損動物の胚盤胞に正常iPS細胞を注入しキメラが成立すると欠損臓器がドナー由来に置換される。本研究ではまず眼球欠損マウスが必要で眼形成マスター遺伝子Pax6に着目した。Pax6は眼胞、水晶体、網膜、角膜に発現しPax6変異マウスはRx遺伝子の存在で前脳から眼胞が突出し頭部表皮外胚葉に接するが水晶体プラコードが誘導されず眼胞は退行変性する。本研究にはPax6ヘテロ変異マウス(B6EiC3Sn　a/A-Pax6Sey-Dey/J)を用いた。眼球摘出し遺伝子解析免疫組織学的解析等を行い、その後ヘテロ型どうしを掛け合わせ眼球欠損マウスの作製を試みた。その過程でヘテロ型は野生型と比較し低体重で成長不良、奇形や視力障害も伴い通常の雌雄勾配や妊娠出産が難しい可能性が生じ、体外受精による受精卵作製と仮親への移植の必要性が高まり、本研究計画においてその過程を追加した。ヘテロ型雄のマウスを、排卵誘発した同雌と交配し受精卵を作製した。一部中断しているが随時本研究を再開し、その後の計画としては、この作製受精卵を仮親子宮に移植後得られた胚盤胞にEGFP標識iPS細胞を注入しドナー由来眼球再生の確認と網膜電図による視機能解析や免疫染色による眼球組織構造解析、遺伝子発現解析を施行し眼球再生モデルを構築する。