細胞再現系での蛋白質の構造・ダイナミクスの解明

阐明细胞繁殖系统中的蛋白质结构和动力学

基本信息

批准号：
18H03681
负责人：
杉山正明
金额：
$ 29.45万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H03681/
关键词：
細胞模倣系重水素化 HSA 中性子散乱混雑系

项目摘要

細胞再現系の構築のために「１．HSA(Human Serum Albumin)の発現系の確立」「２．75%重水素化蛋白質の発現系の確立」「３．重水素化高分子の合成系の確立」に着手した。１に関しては通常は生体(血清)から抽出しているが、今回は重水素化のために大腸菌発現系の確立を目指している。そのためには、発現ベクターの構築・発現確認・発現条件の最適化が必要となる。今回、研究期間は短かったが発現条件の最適化まで既に進めることができた。困難な点は仮にHSAが発現したとしても、HSAは多くのS-S結合で3次元立体構造を形成しているため、正確に3次元構造を取らせるための発現条件の最適化である。現在、正確な3次元構造を取っているHSAの発現は確認できており、大量発現への条件最適化の段階である。2に関しては７５％の重水素化蛋白質の大量発現を行い、その大腸菌破砕溶液をストックしてある。これから、サイズ選別を行い模倣系構築のためのサイズ別蛋白質ストックの構築方法の検討に入る段階である。また、75%αBクリスタリンの高濃度系＝水晶体模倣系を用いた中性子小角散乱測定は既に行った。現在、データ解析の段階である。3に関しては、重水素化率を指定したポリエチレングリコールの合成に成功しており。高分子クラウダーへの応用に進める段階である。これらはこれ間にない細胞模倣系を構築し中性子散乱技術を用いて任意の蛋白質を希薄系と同様の測定を目指す本計画における根幹をなす技術であり、これらの開発を順当に進める事が出来た。また、これらの技術は他の中性子小角散乱測定においても非常に有用であり、その広範囲での利用が期待される。

为了构建细胞再现系统，我们开始“ 1。建立HSA（人血清白蛋白）的表达系统，” 2。建立75％氘化蛋白的表达系统，并“ 3。建立氘化聚合物的合成系统”。关于1，通常是从活生物体（血清）中提取的，但是这次我们的目标是建立大肠杆菌表达系统以进行养育。为此，有必要构造，确认表达载体的表达并优化表达条件。尽管这次研究期很短，但我们能够提高优化表达条件。困难的观点是，即使表达了HSA，HSA通过许多S-S键形成3D三维结构，也是表达条件的优化，以确保精确采用HSA。当前，HSA的表达具有准确的三维结构，已得到证实，并且正处于优化大量表达条件的阶段。关于2个，表达了大量75％的氘化蛋白质，并存储了大肠杆菌破坏溶液。现在，我们开始研究一种构建尺寸特异性蛋白质库存的方法，用于按大小选择按大小构建模拟系统。此外，已经进行了75％αB晶体=镜头模拟系统的高浓度系统的小角度中子散射测量。目前处于数据分析阶段。关于3，我们成功地合成了特定的脱氧速率的聚乙烯乙二醇。这是我们将继续应用于聚合物谱系的阶段。这些技术是构成该项目的基础的技术，该技术旨在构建同时不存在的细胞模拟系统，并使用中子散射技术以与稀释系统相同的方式测量任何蛋白质，并且这些系统的开发能够以顺序进行。此外，这些技术在其他小角度的中子散射测量中非常有用，预计将以多种方式使用。