反応場に着目したpiRNA生合成過程の生化学的解析

聚焦反应场的piRNA生物合成过程生化分析

基本信息

批准号：
18H03982
负责人：
泊幸秀
金额：
$ 28.29万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H03982/
关键词：
piRNA PIWI 反応場

项目摘要

piRNA生合成の最終過程となる3'末端の削り込み反応を担うエクソヌクレアーゼTrimmerを、CRISPR/Cas9を用いてノックアウトしたカイコBmN4細胞の樹立に成功した。その結果、本来28塩基程度の長さを持つ成熟piRNAはほとんど検出されなくなる一方で、32-42塩基程度のpiRNA前駆体と思われるものが蓄積することが確認された。そこで、それらのpiRNA前駆体様のRNAを次世代シーケンサーを用いて解析したところ、3'末端がウリジン(U)の手前で切断されたと思われるものが比較的多く含まれていることが判明した。また、piRNA前駆体のすぐ後から別のpiRNAが作られやすいことも明らかとなった。これらの特徴は、Trimmerノックアウト時に蓄積している32-42塩基程度のRNAが、Trimmerの上流で働くと考えられているエンドヌクレアーゼZucchiniの切断直後の産物であることを示唆していた。そこで、TrimmerノックアウトBmN4細胞から粗抽出液を調整し、試験管内でPIWIタンパク質に取り込ませた長いRNAに加えてみたところ、たしかに成熟体piRNAよりも少し長いところでRNAが切断されること、また、この切断は弱いながらもUの手前を好むことが確認できた。以上のことから、エクソヌクレアーゼTrimmerのノックアウト細胞抽出液を用いることによって、その上流ではたらくエンドヌクレアーゼZucchiniが生体内で本来持っている活性を忠実に再現できる試験管内系が初めて構築できた可能性が高く、今後piRNAの生合成過程を解析するに当たって有用なツールになると思われる。

我们成功地建立了使用CRISPR/CAS9（外核酸酶修剪器）拆除的蚕BMN4细胞，这是负责3'-末端剃须反应的，这是PIRNA生物合成的最终过程。结果，几乎无法检测到最初约有28个基部的成熟piRNA，而似乎是约为32-42碱基的PIRNA前体。因此，当使用下一代序列仪分析piRNA之类的RNA时，发现3'端可能在尿苷（u）之前裂解。还揭示了其他PIRNA可能会在PIRNA前体之后立即产生。这些特征表明，在修剪器敲除处积聚的RNA大约32-42个碱基，是核酸内切酶Zucchini裂解后立即产生的，被认为可以在修剪器的上游起作用。 Therefore, when we prepared the crude extract from Trimmer knockout BmN4 cells and added it to the long RNA that was taken up by the PIWI protein in a test tube, we confirmed that the RNA was cleaved at a slightly longer time than the mature piRNA, and that although this cleavage was weak, it preferred the front of U. Based on the above, it is highly likely that by using knockout cell extracts of exonuclease Trimmer, an in可以忠实地重现上游核酸内核酸酶西葫芦的固有活性的体外系统首次构建了上游，并且很可能将成为分析未来Pirna的生物合成过程的有用工具。