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Preparation of knockout Mouse of a transregulatory fector, OCZF which is specifically expressed inosteoclasts

特异性表达破骨细胞的反调节因子OCZF的敲除小鼠的制备

基本信息

批准号：
15591970
负责人：
KUKITA Akiko
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Saga University (2004)佐賀医科大学 (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15591970/
关键词：
osteoclast transcriptional factor knockout ES cell

项目摘要

To investigate the role of transcriptional regulator, OCZF(Osteoclast zinc finger protein) specifically expressed in osteoclasts, we isolated a genome clone of mouse homologue of OCZF, LRF(Leukocyte-related factor) from mouse BAG clone ES cell genome library and prepared targeted vector which had neomycin resistant gene. ES cells were introduced by targeted vector by electroporation and G418 was added. After selection for 9 days, 500 resistant ES clones were picked up. ES resistant cells were analyzed by PCR and southern analysis and 6 LRF (-/+) ES cell clones were obtained. We then increased the concentration of G418 and obtained LRF(-/-) ES cells to analyze the possibility of osteoclast differentiation in the absence of LRF gene.During the course of the experiments, we are informed that LRF knockout mouse are already prepared by American group and mouse is embryonic lethal. We then determined to collaborate with American group and Japanese group to use LRF knockout mouse.We also performed to knockout OCZF/LRF gene by using siRNA in vitro. We analyzed the condition which is easily introduced RNA and DNA into mouse macrophage cell line, RAW264 and found that RAW 264 cells were introduced by RNA up to 80 % of the cell population by using Nucleofector. Several small RNAis were prepared to repress the expression LRF gene in RAW 264 cells. Introduction of RNAi into RAW 264 cells stimulated with RANKL markedly inhibited osteoclast differentiation of RAW 264 cells.

为了研究破骨细胞中特异性表达的转录调节因子OCZF（破骨细胞锌指蛋白）的作用，我们从小鼠BAG克隆ES细胞基因组文库中分离出OCZF小鼠同源物LRF（白细胞相关因子）的基因组克隆，并制备了具有新霉素抗性基因的靶向载体。通过电穿孔将靶向载体导入ES细胞并添加G418。经过9天的筛选，挑出500个抗性ES克隆。通过PCR和southern分析对ES抗性细胞进行分析，获得6个LRF(-/+)ES细胞克隆。然后我们增加G418的浓度，获得LRF(-/-) ES细胞，分析在没有LRF基因的情况下破骨细胞分化的可能性。在实验过程中，我们得知美国团队已经制备了LRF敲除小鼠，并且小鼠是胚胎致死的。于是我们决定与美国课题组和日本课题组合作使用LRF基因敲除小鼠，并利用siRNA进行体外敲除OCZF/LRF基因。我们分析了将RNA和DNA轻松引入小鼠巨噬细胞系RAW264的条件，发现使用Nucleofector，RAW 264细胞中高达80%的细胞群被RNA引入。制备了几种小RNA来抑制RAW 264细胞中LRF基因的表达。将 RNAi 引入 RANKL 刺激的 RAW 264 细胞中，显着抑制 RAW 264 细胞的破骨细胞分化。

项目成果

期刊论文数量（52）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Possible involvement of MIP-1alpha in the recruitment of osteoclast progenitors to the distal tibia in rats with adjuvant-induced arthritis.

MIP-1α 可能参与佐剂诱导关节炎大鼠破骨细胞祖细胞向胫骨远端的募集。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Lab. Invest. 84
影响因子：
0
作者：
Toh K.;Kukita T.;Wu Z.;Kukita A.;Sandra F.;Tang Q-Y.;Nomiyama H.;Iijima T.
通讯作者：
Iijima T.

Direct stimulation of osteoclastogenesis by MIP-1α ; Evidence obtained from studies using RAW264 cell clone highly sesponsive to RANKL

MIP-1α 直接刺激破骨细胞生成；从使用对 RANKL 高度敏感的 RAW264 细胞克隆进行的研究中获得的证据

DOI：
发表时间：
2003
期刊：
J.Endocrinology 180-1
影响因子：
0
作者：
Noshiro;M.;Kawamoto;T.;et al.;Watanabe T. et al.
通讯作者：
Watanabe T. et al.

Direct stimulation of osteoclastogenesis by MIP-1α:: evidence obtained from studies using RAW264 cell clone highly responsive to RANKL

DOI：
10.1677/joe.0.1800193
发表时间：
2004-01-01
期刊：
JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY
影响因子：
4
作者：
Watanabe, T;Kukita, T;Iijima, T
通讯作者：
Iijima, T

破骨細胞機能の膜表面を介した制御(特集骨の細胞と形態機能)

通过膜表面控制破骨细胞功能（骨细胞和形态功能的特殊功能）

DOI：
发表时间：
2003
期刊：
Clinical Calcium 13
影响因子：
0
作者：
Ohishi M.;Ohishi M. et al.;Kukita T.;Ikeda F.;Toh K.;Z.Wu;Toh K.et al.;Ikeda F. et al.;Kukita T. et al.;Toh K.;Kukita T.;Zheng CL;M.Rahman;久木田敏夫
通讯作者：
久木田敏夫

久木田敏夫: "破骨細胞機能の膜表面受容体を介した制御(特集骨の細胞と形態機能)"Clinical Calcium. 13. 444-448 (2003)

Toshio Kukita：“通过膜表面受体调节破骨细胞功能（骨细胞和形态功能的特殊特征）”临床钙。13。444-448（2003）