コウモリコロナウイルスのリスク評価ならびに高感度ウイルス検出法の開発に資する研究

コウモリは、コロナウイルスの自然宿主の一つであるため、コウモリが保有するコロナウイルスのサーベイランスは、将来的に発生しうる人獣共通感染症の予測のためにも重要である。コロナウイルス遺伝子を検出する方法として、RT-PCR法と次世代シークエンス法が用いられているが、それぞれ、特異的なウイルス遺伝子しか検出できない、あるいは感度が低いといった問題がある。そこで本研究では、コロナウイルスを網羅的かつ高感度に検出するために、バイオインフォマティクス解析によって設計した縮重プライマーを用いたRT-PCR法の確立を試みた。バイオインフォマティクス解析によって、データベースに登録されている数百種類のコロナウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子配列に対する39種類の縮重プライマーを設計した。これらのプライマーペアを用いて、RT-PCRの条件設定を行ない、最適なプライマー濃度、アニーリング温度、PCR酵素等を決定した。最適化した条件下で、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、デルタコロナウイルスから抽出したRNAを用いてRT-PCRを行ったところ、目的のサイズである400から450bp付近にバンドが検出された。以上、本研究では、縮重プライマーを用いて、コロナウイルス遺伝子を包括的に検出できるRT-PCR法を確立した。現在、本手法が野外サンプルに対しても有効であるかを検証するために、アフリカ・シエラレオネで採取したコウモリ臓器から抽出したRNAを用いて、コロナウイルスゲノムの検出を試みている。

コウモリは、コロナウイルスの自然宿主の一つであるため、コウモリが保有するコロナウイルスのサーベイランスは、将来的に発生しうる人獣共通感染症の予測のためにも重要である。コロナウイルス遺伝子を検出する方法として、RT-PCR法と次世代シークエンス法が用いられているが、それぞれ、特異的なウイルス遺伝子しか検出できない、あるいは感度が低いといった問題がある。そこで本研究では、コロナウイルスを網羅的かつ高感度に検出するために、バイオインフォマティクス解析によって設計した縮重プライマーを用いたRT-PCR法の確立を試みた。バイオインフォマティクス解析によって、データベースに登録されている数百種類のコロナウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子配列に対する39種類の縮重プライマーを設計した。これらのプライマーペアを用いて、RT-PCRの条件設定を行ない、最適なプライマー濃度、アニーリング温度、PCR酵素等を決定した。最適化した条件下で、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、デルタコロナウイルスから抽出したRNAを用いてRT-PCRを行ったところ、目的のサイズである400から450bp付近にバンドが検出された。以上、本研究では、縮重プライマーを用いて、コロナウイルス遺伝子を包括的に検出できるRT-PCR法を確立した。現在、本手法が野外サンプルに対しても有効であるかを検証するために、アフリカ・シエラレオネで採取したコウモリ臓器から抽出したRNAを用いて、コロナウイルスゲノムの検出を試みている。