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Establishment of reconstituting method for G protein-coupled receptor into artificial membranes

G蛋白偶联受体人工膜重构方法的建立

基本信息

批准号：
22H02585
负责人：
林文夫
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

人工膜研究は生体膜の構造や機能を理解する有力な手段てである。特に、ガラス基板に支持された脂質二層膜(Supported Lipid Bilayer: SLB) は高い安定性と多様な表面測定技術を活用できるという利点を持ち、センサーチップ開発などへの応用も期待できる。しかし、SLBに膜タンパク質をうまく組み込むのは依然困難な課題である。本研究計画では、「擬平衡ナノディスク」を使った新しいSLB形成法と、独自の「パターン化重合脂質二層膜技術」を融合させることによって、膜タンパク質のSLBへの効率的かつ高い配向性を持った組込方法を確立することを目的としている。光受容体ロドプシン (Rh)とそれに共役するGタンパク質トランスデューシン(Gt) を、医薬品標的の大半を占めるGタンパク質共役型受容体(GPCR)のモデル分子として採用している。初年度は、SLBへのRh組込み効率の向上と、配向性の高いRh組込み法を実現することが目的であったがいずれもほぼ達成できた。具体的には、N末の糖鎖やC末（Gt結合側）システイン残基に蛍光色素を付加したRhを調製し、いずれも可動性で、数10分子/μm2以上の組込に成功した。さらに、配向性の高いRh組込みには、Rhに光依存的にGtを結合させてRh*-Gt複合体を作り、これを脂質と共にナノディスクに入れSLBに展開した。ナノディスクがSLBとして伸展していく際にC末を上にするようにバイアスがかかるため、RhがおのずからC末を上に配向すると予想したものだ。また、この複合体は GTPによって解離するため、組み込まれた蛍光標識GtがGTP添加によって高速拡散すればRhがC末を上にして組み込まれていることが実証できる。これまでの実験で、GTPによるGtの高速化が認められ、我々が目的を達成する確度は格段に向上した。

Artificial membrane research is a powerful tool for understanding the structure and function of biological membranes. Special substrate Supported Lipid Bilayer (SLB) has high stability and multi-surface measurement technology. SLB is still a difficult task. This project aims to establish a new SLB formation method based on "quasi-equilibrium" and a separate "two-layer lipid membrane technology" for the purpose of integrating the SLB formation method with the SLB formation method. Photoreceptor (Rh) is used in conjunction with GPCR, which accounts for the majority of medical and pharmaceutical standards. In the first year, the Rh group of SLB was selected from the group consisting of the following components: The specific sugar chain at the end of N and C (Gt-binding side) was successfully modulated by the addition of light pigment at the end of N, and the mobility of Rh was increased by more than 10 molecules/μm2. In addition, the Rh group with high alignment and light dependence is bound to Rh*-Gt complex. When you're in the middle of the game, you're in the middle of the game. The complex GTP was added to the system. The goal of GTP is to increase the speed of GTP.