Establishment of reconstituting method for G protein-coupled receptor into artificial membranes

G蛋白偶联受体人工膜重构方法的建立

• 批准号: 22H02585
• 负责人: 林 文夫
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02585/
• 关键词: 人工膜; GPCR; Gタンパク質; ペプチドナノディスク; 組込み方法; 支持脂質二層膜; Gタンパク質信号系; ロドプシン; トランスデューシン; 再構成; タンパク質組込み膜; 蛍光一分子観察; ナノディスク

人工膜研究は生体膜の構造や機能を理解する有力な手段てである。特に、ガラス基板に支持された脂質二層膜(Supported Lipid Bilayer: SLB) は高い安定性と多様な表面測定技術を活用できるという利点を持ち、センサーチップ開発などへの応用も期待できる。しかし 、SLBに膜タンパク質をうまく組み込むのは依然困難な課題である。本研究計画では、「擬平衡ナノディスク」を使った新しいSLB形成法 と、独自の「パターン化重合脂質二層膜技術」を融合させることによって、膜タンパク質のSLBへの効率的かつ高い配向性を持った組込方法を 確立することを目的としている。光受容体ロドプシン (Rh)とそれに共役するGタンパク質トランスデューシン(Gt) を、医薬品標的の大半を占めるGタンパク質共役型受容体(GPCR)のモデル分子として採用している。初年度は、SLBへのRh組込み効率の向上と、配向性の高いRh組込み法を実現することが目的であったがいずれもほぼ達成できた。具体的には、N末の糖鎖やC末（Gt結合側）システイン残基に蛍光色素を付加したRhを調製し、いずれも可動性で、数10分子/μm2以上の組込に成功した。さらに、配向性の高いRh組込みには、Rhに光依存的にGtを結合させてRh*-Gt複合体を作り、これを脂質と共にナノディスクに入れSLBに展開した。ナノディスクがSLBとして伸展していく際にC末を上にするようにバイアスがかかるため、RhがおのずからC末を上に配向すると予想したものだ。また、この複合体は GTPによって解離するため、組み込まれた蛍光標識GtがGTP添加によって高速拡散すればRhがC末を上にして組み込まれていることが実証できる。これまでの実験で、GTPによるGtの高速化が認められ、我々が目的を達成する確度は格段に向上した。

Artificial membranes are a powerful な means to study the <s:1> structure, や function and を of <s:1> biological membranes and understand する. に, ガ ラ ス substrate に support さ れ た Lipid membrane on the second floor (Supported Lipid Bilayer: SLB) high は い stability と others な surface measurement technology を use で き る と い う tartness を hold ち, セ ン サ ー チ ッ プ open 発 な ど へ の 応 with も expect で き る. The <s:1> な な, SLBに membrane タ, パ パ, and the をうまく group of purlins み込む and <e:1> are still struggling with the な subject である. This research project で は and "quasi equilibrium ナ ノ デ ィ ス ク" を make っ た new し い SLB と forming method, の alone "パ タ ー ン overlap lipid layer membrane technology" を fusion さ せ る こ と に よ っ て, membrane タ ン パ ク qualitative の SLB へ の sharper rate か つ い with high tropism を hold っ 込 method を た group established す る こ と を purpose と し て い る. Light by let body ロ ド プ シ ン (Rh) と そ れ に す total service る G タ ン パ ク qualitative ト ラ ン ス デ ュ ー シ ン を (Gt), medical 薬 mark の accounted for more than half を め る G タ ン パ ク type total service quality by the capacity of body (GPCR) の モ デ ル molecular と し て using し て い る. Early annual は, SLB へ の Rh group 込 み の と upward working rate, with high tropism の い Rh group 込 を み method be presently す る こ と が purpose で あ っ た が い ず れ も ほ ぼ reached で き た. Specific に は, N や の sugar at the end of the lock at the end of the C (Gt) combined with side シ ス テ イ ン residues に 蛍 photopigment を plus し た Rh を modulation し, い ず れ も mobility で group, number 10 m2 more molecular/mu の 込 に successful し た. さ ら に, tropism の high い Rh group 込 み に は, Rh に light dependent に Gt を combined さ せ て Rh * - Gt complex を り, こ れ を lipid と altogether に ナ ノ デ ィ ス ク に into れ SLB に expand し た. ナ ノ デ ィ ス ク が SLB と し て stretch し て い on at the end of the event く に C を に す る よ う に バ イ ア ス が か か る た め, Rh が お の ず か ら C を に on at the end of the match to す る と to think し た も の だ. ま た, こ の complex は GTP に made よ っ て dissociation す る た め, group み 込 ま れ た 蛍 light logo Gt が GTP add made に よ っ て high-speed company, scattered す れ ば に on at the end of the Rh が C を し て group み 込 ま れ て い る こ と が card be で き る. こ れ ま で の be 験 で, GTP に made よ る Gt high speed の が recognize め ら れ, I 々 が purpose を reach す る accuracy of は lattice period に upward し た.

项目成果

パターン化人工膜へのエクソソーム導入技術の開発

图案化人工膜外泌体导入技术的开发

• 发表时间: 2022
• 作者: 吉村 優;杉町 純音;林 文夫;廣澤 幸一朗;笠井 倫志;鈴木 健一;森垣 憲一
• 通讯作者: 森垣 憲一

Nanofluidic Model Membrane for the Single-Molecule Observation of Membrane Proteins

• DOI: 10.1021/acs.langmuir.2c00724
• 发表时间: 2022-05-31
• 期刊: LANGMUIR
• 影响因子: 3.9
• 作者: Komatsu，Ryota;Tanimoto，Yasushi;Morigaki，Kenichi
• 通讯作者: Morigaki，Kenichi

Reconstitution of photoreceptor rhodopsin into a patterned model membrane using peptide nanodisc

使用肽纳米盘将光感受器视紫红质重构为图案化模型膜

• 发表时间: 2022
• 作者: Masato Koezuka;Fuko Kueda;Fumio Hayashi;Kenichi Morigaki
• 通讯作者: Kenichi Morigaki

Retarded diffusion and confinement of membrane-bound molecules in a patterned hybrid membrane of phospholipid bilayers and monolayers

磷脂双层和单层图案化杂化膜中膜结合分子的延迟扩散和限制

• DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c06053
• 发表时间: 2023
• 期刊: J. Phys. Chem. B
• 影响因子: 3.3
• 作者: Tanimoto;Y.;Yoshimura;Y.;Hayashi;F.;Morigaki;K.
• 通讯作者: K.