特殊な両親媒性物質による表在性膜蛋白質の選択的可溶化

特殊两亲物选择性溶解表面膜蛋白

• 批准号: 14658205
• 负责人: 林 文夫
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658205/
• 关键词: シクロデキストリン; 膜蛋白質; 可溶化; PDE6; 脂質修飾; トランスデューシン; G蛋白質; 視細胞

メチルβシクロデキストリン(MCD)やクロモサポニン(CSI)といつた特殊な構造をした両親媒性物質によって膜表在性蛋白質が選択的に可溶化されという発見から,本研究計画の実施に至った.その結果、(1)薬剤が脂質修飾膜蛋白質を可溶化する分子メカニズムは,蛋白質の脂質修飾部位への直接的な結合による可能性が示唆された.(2)MCDで可溶化された脂質修飾膜蛋白質は安定化されており,これまで不可能とされたカエル視細胞外節膜のcGMP加水分解酵素(PDE6)の活性型と不活性型両方の可溶化と精製に成功した.(3)不活性型トランスデューシンの精製にも成功し,これをBlue-Sepharoseにかけることで,Tα及びTβγを簡単にほぼ単一にまで精製できた.(4)ファルネシル基で修飾されているロドプシンキナーゼについても視細胞外節膜MCD抽出物から陽イオン交換カラムで100%の精製物が得らた.上記のいずれの蛋白質精製においても回収率は80%を越えている.(5)MCDによるトランスデューシンやPDE6の可溶化の度合はこれら蛋白質と膜との相互作用を反映しており,暗黒中ではいずれもK_<1/2>が約2mM MCDであつたが,光照射でトランスデューシンは不溶となった.また,PDE6はGTPgSと光による恒常的活性化によってK_<1/2>が5mMに増加した.これらの知見は信号系蛋白質と膜との相互作用の理解に大きく貢献する.CSIについてはMCDより一桁ほど低濃度で有効であること,トランスデューシンと光退色ロドプシンとの相互作用にも影響を与えることなどが判明しているがまだ検討が進んでいない.PIらは以上の成果を活用して,活性型PDE6を蛍光標識した阻害サブユニットと再構成することにも成功し、生きた視細胞円板膜上でのPDE6の一分子観察を計画している。また,MCDによる信号系蛋白質の選択的可溶化と蛋白質精製への利用については論文執筆中である.

The research project was carried out to the end of this study. The results are as follows: (1) The molecular structure of lipid modified membrane protein solubilization is discussed, and the possibility of direct binding between lipid modified sites of protein is shown. (2)MCD solubilized lipid modified membrane protein was stabilized and purified successfully by solubilization of active and inactive forms of cGMP hydrolytic enzyme (PDE6) in the outer segment membrane of human visual cells. (3)The purification of the inactive form of the enzyme was successful, and the purification of Tα and Tβγ was successful. (4)A 100% purified product was obtained from the MCD extract of the outer segment membrane of the visual cell. The recovery rate of protein in the above mentioned products is 80%. (5) The solubility of PDE6 in MCD is reflected in the interaction between protein and membrane, and the solubility of PDE 6 in MCD is reflected in the interaction between protein and membrane. PDE6 showed a constant activation of GTPgS in the presence of light, and K_<1/2> increased to 5 mM. CSI has contributed greatly to understanding the interaction between signal system proteins and membranes. CSI has contributed greatly to understanding the interaction between signal system proteins and membranes. CSI has contributed greatly to understanding the interaction between signal system proteins and membranes. CSI has contributed greatly to understanding the interaction between signal system proteins and membranes. Active PDE6 is identified by light and re-constructed by molecular detection of PDE6 on the cell membrane. MCD signal system protein selection solubilization and protein purification utilization.

项目成果

Han Liu: "Active Transducin α Subunit Carries PDE6 to Detergent-Resistant Membranes in Rod Photoreceptor Outer Segments"Biochem. Biophys. Res. Commun.. (in press). (2003)

Han Liu：“活性转导蛋白 α 亚基将 PDE6 携带到杆光感受器外节中的耐洗涤剂膜”Biochem Res。（出版中）。

Han Liu: "Signaling Protein Complex Formation in Detergent Resistant Membrane of Bovine Photoreceptor Rod Outer Segments"J. Photoscience. 9(2). 275-277 (2002)

刘瀚：“牛感光杆外节耐洗涤剂膜中信号蛋白复合物的形成”J。

Fumio Hayashi: "A Possible Significance in Vertebrate Phototransduction of Multi-Protein Signaling Complexes on Raft-Like Membranes"J. Photoscience. 9(2). 47-50 (2002)

Fumio Hayashi：“类筏膜上多蛋白信号复合物在脊椎动物光转导中的可能意义”J。

林 文夫: "視細胞光受容膜でのラフトの発見"生物物理. 42(6). 301-304 (2002)

Fumio Hayashi：“光感受器膜中筏的发现”生物物理学 42(6) (2002)。