特殊な両親媒性物質による表在性膜蛋白質の選択的可溶化

特殊两亲物选择性溶解表面膜蛋白

基本信息

批准号：
14658205
负责人：
林文夫
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

メチルβシクロデキストリン(MCD)やクロモサポニン(CSI)といつた特殊な構造をした両親媒性物質によって膜表在性蛋白質が選択的に可溶化されという発見から,本研究計画の実施に至った.その結果、(1)薬剤が脂質修飾膜蛋白質を可溶化する分子メカニズムは,蛋白質の脂質修飾部位への直接的な結合による可能性が示唆された.(2)MCDで可溶化された脂質修飾膜蛋白質は安定化されており,これまで不可能とされたカエル視細胞外節膜のcGMP加水分解酵素(PDE6)の活性型と不活性型両方の可溶化と精製に成功した.(3)不活性型トランスデューシンの精製にも成功し,これをBlue-Sepharoseにかけることで,Tα及びTβγを簡単にほぼ単一にまで精製できた.(4)ファルネシル基で修飾されているロドプシンキナーゼについても視細胞外節膜MCD抽出物から陽イオン交換カラムで100%の精製物が得らた.上記のいずれの蛋白質精製においても回収率は80%を越えている.(5)MCDによるトランスデューシンやPDE6の可溶化の度合はこれら蛋白質と膜との相互作用を反映しており,暗黒中ではいずれもK_<1/2>が約2mM MCDであつたが,光照射でトランスデューシンは不溶となった.また,PDE6はGTPgSと光による恒常的活性化によってK_<1/2>が5mMに増加した.これらの知見は信号系蛋白質と膜との相互作用の理解に大きく貢献する.CSIについてはMCDより一桁ほど低濃度で有効であること,トランスデューシンと光退色ロドプシンとの相互作用にも影響を与えることなどが判明しているがまだ検討が進んでいない.PIらは以上の成果を活用して,活性型PDE6を蛍光標識した阻害サブユニットと再構成することにも成功し、生きた視細胞円板膜上でのPDE6の一分子観察を計画している。また,MCDによる信号系蛋白質の選択的可溶化と蛋白質精製への利用については論文執筆中である.

这项研究计划是由于发现膜表面蛋白被带有特殊结构（例如甲基β-环糊精（MCD）（MCD））和染色体蛋白（CSI）选择性溶解性溶解的结果。结果，有人提出（1）药物溶解脂质修饰的膜蛋白的分子机制可能是由于蛋白质与脂质改性位点的直接结合所致。（2）在MCD中溶解的脂质修饰的膜蛋白已稳定，我们已经成功地溶解和纯化了Frog Photopogepeptor的细胞外膜的CGMP水解酶（PDE6）的活性和非活动形式，这是不可能的。（3）我们还成功地纯化了非活性透明蛋白，并将其应用于蓝色 - 雪糖，Tα和Tβγ很容易被纯化为几乎单一。（4）对于用法尼基修饰的视紫红质激酶，从光感受器的细胞外膜MCD提取物中获得100％纯化的产物。上述任何蛋白质净化的回收率均超过80％。（5）MCD对跨丁蛋白和PDE6的溶解度反映了这些蛋白质与膜之间的相互作用，在深色K_ <1/2>中，大约是2 mm。尽管它是MCD，但透性素对光照射变得不溶。此外，由于GTPG和光的本构激活，PDE6将K_ <1/2>增加到5mm。这些发现极大地有助于理解信号蛋白与膜之间的相互作用。已经发现，CSI的浓度比MCD低约数量级有效，并且还会影响跨多霉素和光漂白视紫红质之间的相互作用，但没有进一步研究。使用上述结果，PI和其他结果已成功地重构了具有荧光标记抑制性亚基的活性PDE6，并计划在实时光感受器盘膜上观察PDE6的单个分子。此外，我目前正在撰写有关MCD对基于信号的蛋白质化溶解的论文及其用于蛋白质纯化的论文。