ヒト前頭葉脳オルガノイドを起点としたin vitro病態モデルを用いた創薬戦略

从人额叶脑类器官开始使用体外病理模型的药物发现策略

• 批准号: 22H02771
• 负责人: 小坂田 文隆
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02771/
• 关键词: オルガノイド; アセンブロイド; パターニング; 領域間相互作用; CRISPR-Cas9; ゲノム編集; 構成論的アプローチ; 前頭葉; 視床; 透明化; CRISPR/Cas9

創薬開発において神経・精神疾患分野で新薬が承認される確率は極めて低い。その原因として、統合失調症などの精神疾患では、ヒト高次脳機能を担う前頭葉に機能異常が認められるにも関わらず、ヒト前頭葉の機能を模した評価系がないことが挙げられる。この問題点を解決するために、本研究では、ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）から前頭葉オルガノイドと異なる脳領域オルガノイドを誘導し、それらを融合させることで前頭葉アセンブロイドを作製し、領域間相互作用をin vitroで再構成し、ヒト前頭葉機能をin vitroで再現することを目指す。まずヒト脳における大脳皮質と視床の相互作用を再構成するために、ヒトiPS細胞より大脳皮質オルガノイドと視床オルガノイドの誘導を試みた。単一細胞にばらしたヒトiPS細胞をv-bottom well plateに播種し、細胞塊を形成させた。細胞塊に、大脳皮質の発生と視床の発生に必要な因子を適切なタイミングで適切な濃度で段階的に処置した。形成したオルガノイドにける脳領域特異的なマーカーの発現はqPCRにより評価し、オルガノイドの構造は切片を作製し、細胞種、細胞形態、層構造を各種マーカータンパク質に対する免疫染色により評価した。その結果、大脳皮質オルガノイドは、特異的なマーカーを発現し、極性を有する層構造を形成した。視床オルガノイドは、大脳皮質オルガノイドとは異なる構造を形成し、視床特異的なマーカーを発現していた。次いで、アセンブロイド内の領域間相互作用を明らかにするために、緑色蛍光タンパク質のEYFPあるいは赤色蛍光タンパク質のmCherryをKnock-inしたヒトiPS細胞株を樹立した。ヒトiPS細胞をCRISPR/Cas9システムを用いて高効率かつ低毒性にゲノム編集を行うために、プラスミドの導入方法や細胞のセレクション方法などの条件検討を行い、最適化を行った。

The development of new drugs にお にお て in Shinto Shinto the division of mental disorders で new drugs が admit that the される accuracy rate <e:1> is extremely めて low <e:1>. そ の reason と し て, identity disorder な ど の mental disorders で は, ヒ ト 脳 function を bear high times う front leaf に parafunction が recognize め ら れ る に も masato わ ら ず, ヒ ト front leaf の function を die し た review 価 department が な い こ と が 挙 げ ら れ る. こ の problem point を す る た め に, this study で は, ヒ ト pluripotent stem cells (iPS cells) か ら front leaf オ ル ガ ノ イ ド と different な る 脳 field オ ル ガ ノ イ ド を induced し, そ れ ら を fusion さ せ る こ と で front leaf ア セ ン ブ ロ イ ド を cropping し を interaction in between, domain vitroで reconstitutes the <s:1> and ヒト anterior lobe function をin vitroで reproduces する とを とを とを finger す. ま ず ヒ ト 脳 に お け る big 脳 cortex と depending on bed の を interaction to form す る た め に, ヒ ト iPS cells よ り big 脳 cortex オ ル ガ ノ イ ド と depending on bed オ ル ガ ノ イ ド の induced を try み た. Youdaoplaceholder0 one cell にばら たヒト たヒトiPS cells をv-bottom well plateに seeding the nuclei and the cell blocks を form させた. Cell block に, big 脳 cortex の 発 と raw apparent bed の 発 raw に な necessary factor を appropriate な タ イ ミ ン グ で appropriate な concentration で Duan Jie of に 処 buy し た. Form し た オ ル ガ ノ イ ド に け る 脳 domain specific な マ ー カ ー の 発 now は qPCR に よ り review 価 し, オ ル ガ ノ イ ド の tectonic は し the slice を cropping, cells, cell morphology, layer structure を various マ ー カ ー タ ン パ ク qualitative に す seaborne る immune dyeing に よ り review 価 し た. そ の results, large 脳 cortex オ ル ガ ノ イ ド は, specific な マ ー カ ー を 発 し now, polarity を す る を layer structure to form し た. Depending on the bed オ ル ガ ノ イ ド は, big 脳 cortex オ ル ガ ノ イ ド と は different な る tectonic を bed し, depending on the specific な マ ー カ ー を 発 now し て い た. Time い で, ア セ ン ブ ロ イ ド interaction between internal の を Ming ら か に す る た め 蛍 に, green light タ ン パ ク qualitative の EYFP あ る い は red light 蛍 タ ン パ ク qualitative の mCherry を if in し た ヒ ト iPS cell lines を set し た. ヒ ト iPS cells を CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を with い て high working rate か つ low toxicity に ゲ ノ line compiling を ム う た め に, プ ラ ス ミ ド の import cell の や セ レ ク シ ョ ン method な ど の conditions 検 lines for を い, optimization を っ た.

项目成果

脳を知り、作り、操ることで、新たな治療を目指す

通过理解、创造和操纵大脑来寻求新的治疗方法

• 发表时间: 2022
• 作者: Kushima Itaru;Lo Tzuyao;Aleksic Branko;Ozaki Norio;武部貴則;西川昌志, 本多政夫, 金子周一;Kawakatsu-Hatada Y,Murata S,Mori A,Kimura K,Taniguchi H.;小坂田文隆
• 通讯作者: 小坂田文隆

霊長類ES細胞由来オルガノイド複合体を用いた脳モデルの構築と病態モデルへの応用

利用灵长类 ES 细胞类器官复合物构建脑模型及其在病理模型中的应用

• 发表时间: 2023
• 作者: 小寺知輝，竹内遼介;佐藤彰典;小坂田文隆
• 通讯作者: 小坂田文隆

脳機能の理解と新規治療戦略の創出を目指して

旨在了解大脑功能并制定新的治疗策略

• 发表时间: 2023
• 作者: Nakano Michitaka;Taguchi Ryosuke;Kikushige Yoshikane;Isobe Taichi;Miyawaki Kohta;Mizuno Shinichi;Tsuruta Nobuhiro;Hanamura Fumiyasu;Yamaguchi Kyoko;Yamauchi Takuji;Ariyama Hiroshi;Kusaba Hitoshi;Nakamura Masafumi;Maeda Takahiro;Kuo Calvin J.;Baba Eishi;Ak;小坂田文隆
• 通讯作者: 小坂田文隆

視覚運動予測誤差を処理する大脳皮質の階層ネットワーク

大脑皮层中处理视觉运动预测错误的分层网络

• 发表时间: 2022
• 作者: 常深泰司;石黒雄太;鎧坂朝子;服部信孝;小坂田文隆
• 通讯作者: 小坂田文隆

An in vitro non-human primate brain model using assembloids derived from embryonic stem cells

使用源自胚胎干细胞的组合体的体外非人类灵长类动物大脑模型

• 发表时间: 2022
• 作者: Tomoki Kodera;Taiki Hara;Nao Morimoto;Ryosuke Takeuchi;Fumitaka Osakada
• 通讯作者: Fumitaka Osakada