Ｒａｄ５１リコンビナーゼによるＤＮＡ鎖交換反応の分子機構

Rad51重组酶DNA链交换反应的分子机制

• 批准号: 15J08408
• 负责人: 伊藤 健太郎
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J08408/
• 关键词: Homologous Recombination; Rad51; Swi5-Sfr1; 相同組換え; 分裂酵母

相同組換えの中心的な反応であるDNA鎖交換はRad51リコンビナーゼによって触媒される。この反応では、まずDNA二重鎖切断末端がプロセッシングされてできた単鎖DNAにRad51が結合しヌクレオプロテインフィラメントを形成する。そして、この高次複合体が二重鎖DNAをキャッチし相同配列の検索、相同二重鎖とのDNA鎖交換反応をおこなう。我々はこれまでにRad51の活性化因子として分裂酵母Swi5-Sfr1複合体を同定した。本研究ではSwi5-Sfr1複合体が多段階反応であるDNA鎖交換の各段階にどのように作用するか調べるために、オリゴDNAの末端に蛍光基を付加し蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用して反応中間体形成と最終産物の生成をリアルタイムに観察する系を構築した。解析の結果、DNA鎖交換反応では二つの中間体を経て最終産物が生成されること。中間体の形成にはRad51のATP結合、中間体の遷移・最終産物の形成にはRad51のATPase活性が重要であることがわかった。更にSwi5-Sfr1複合体は、Rad51のATPase活性依存的に中間体の遷移・最終産物の生成を強く促進することが明らかになった。さらに、Rad51-単鎖DNAフィラメント表面に露出していると予想されるアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変異体を147種作製し、分裂酵母の遺伝学的性質を利用してSwi5-Sfr1との相互作用に特異的に欠損のあるRad51変異体を9種分離した。そのうち1種について解析を行った結果、野生型に比べATPase活性が遅くなり、Swi5-Sfr1複合体によって中間体の遷移・最終産物生成がほとんど促進されないことがわかった。この結果は生体内でもRad51のATPase活性にカップルしたSwi5-Sfr1複合体によるDNA鎖交換反応の促進が重要であることを支持する。

The な anti-応 であるDNA lock at the same group exchange え <s:1> center exchanges <s:1> Rad51リコ <e:1> ビナ ゼによって ゼによって ゼによって catalyst される. こ の anti 応 で は, ま ず DNA double lock to cut off the end が プ ロ セ ッ シ ン グ さ れ て で き た 単 lock DNA に Rad51 が combining し ヌ ク レ オ プ ロ テ イ ン フ ィ ラ メ ン ト を form す る. そ し て, こ の high order complex が DNA double lock を キ ャ ッ チ し with same column の 検 rope, double lock same と の DNA lock exchange the 応 を お こ な う. I 々, を, れまでに, れまでに, Rad51 <s:1> activator と, て て, splitter yeast Swi5-Sfr1 complex を, た た. This study で は Swi5 - more than Sfr1 complex が Duan Jie anti 応 で あ る DNA lock exchange の paragraphs order に ど の よ う に role す る か adjustable べ る た め に, オ リ ゴ DNA の end に 蛍 light base pay plus し を 蛍 resonance light エ ネ ル ギ ー mobile (FRET) の principle を using し て generated を 応 intermediates の と final products リ ア ル タ イ ム に 観 Observe the する system を to construct た. The result of the <s:1> analysis, the DNA lock-exchange reverse 応で 応で <s:1> <s:1> intermediate を を is then passed through the て final product が to generate される と と と と. Intermediates の form に は Rad51 の ATP, intermediates の migration, end product の form に は Rad51 の ATPase activity が important で あ る こ と が わ か っ た. More に Swi5 - Sfr1 complex は, Rad51 の ATPase activity dependent に intermediates の migration, end product の generate strong を く promote す る こ と が Ming ら か に な っ た. さ ら に, Rad51 - 単 lock DNA フ ィ ラ メ ン ト surface に reveal し て い る と to think さ れ る ア ミ ノ acid を そ れ ぞ れ ア ラ ニ ン に replacement し た - variant を し the 147 kinds of cropping, divided the nature of the yeast の but 伝 learn を using し て Swi5 - Sfr1 と の に specific interaction between に owe loss の あ る Rad51 - variant を 9 kinds of separation Youdaoplaceholder0 た. 1 そ の う ち に つ い analytical line を っ て た results, wild type に than べ ATPase activity が 遅 く な り, Swi5 Sfr1 complex に よ っ て intermediates の migration, end product generated が ほ と ん ど promote さ れ な い こ と が わ か っ た. こ の results は born in vivo で も Rad51 の ATPase activity に カ ッ プ ル し た Swi5 - Sfr1 complex に よ る DNA lock exchange the 応 の promote が important で あ る こ と を support す る.

项目成果

Glu150 of schizoaccharoyces pombe Rad51 is important for functional interaction with the Swi5-Sfr1 complex

裂殖酵母 Rad51 的 Glu150 对于与 Swi5-Sfr1 复合物的功能相互作用很重要

• 发表时间: 2015
• 作者: 伊藤健太郎

分裂酵母Rad51依存的DNA鎖交換反応のリアルタイム解析

裂殖酵母中 Rad51 依赖性 DNA 链交换反应的实时分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 渡邉洋輔;古川英光;伊藤健太郎
• 通讯作者: 伊藤健太郎

Swi5-Sfr1 facilitates converting three-strand intermediates to the final products in DNA strand exchange reaction mediated by Rad51

Swi5-Sfr1 有助于在 Rad51 介导的 DNA 链交换反应中将三链中间体转化为最终产物

• 发表时间: 2016
• 作者: 齊藤 梓; 渡邉 洋輔; ハスナット カビル; 宮 瑾; 川上 勝; 古川 英光;伊藤健太郎
• 通讯作者: 伊藤健太郎

分裂酵母 Swi5-Sfr1 による Rad51 DNA 鎖交換反応の活性化メカニズム

裂殖酵母Swi5-Sfr1激活Rad51 DNA链交换反应的机制

• 发表时间: 2015
• 作者: 伊藤健太郎;原口啓介;岩﨑博史
• 通讯作者: 岩﨑博史