Ｒａｄ５１リコンビナーゼによるＤＮＡ鎖交換反応の分子機構

相同組換えの中心的な反応であるDNA鎖交換はRad51リコンビナーゼによって触媒される。この反応では、まずDNA二重鎖切断末端がプロセッシングされてできた単鎖DNAにRad51が結合しヌクレオプロテインフィラメントを形成する。そして、この高次複合体が二重鎖DNAをキャッチし相同配列の検索、相同二重鎖とのDNA鎖交換反応をおこなう。我々はこれまでにRad51の活性化因子として分裂酵母Swi5-Sfr1複合体を同定した。本研究ではSwi5-Sfr1複合体が多段階反応であるDNA鎖交換の各段階にどのように作用するか調べるために、オリゴDNAの末端に蛍光基を付加し蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用して反応中間体形成と最終産物の生成をリアルタイムに観察する系を構築した。解析の結果、DNA鎖交換反応では二つの中間体を経て最終産物が生成されること。中間体の形成にはRad51のATP結合、中間体の遷移・最終産物の形成にはRad51のATPase活性が重要であることがわかった。更にSwi5-Sfr1複合体は、Rad51のATPase活性依存的に中間体の遷移・最終産物の生成を強く促進することが明らかになった。さらに、Rad51-単鎖DNAフィラメント表面に露出していると予想されるアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変異体を147種作製し、分裂酵母の遺伝学的性質を利用してSwi5-Sfr1との相互作用に特異的に欠損のあるRad51変異体を9種分離した。そのうち1種について解析を行った結果、野生型に比べATPase活性が遅くなり、Swi5-Sfr1複合体によって中間体の遷移・最終産物生成がほとんど促進されないことがわかった。この結果は生体内でもRad51のATPase活性にカップルしたSwi5-Sfr1複合体によるDNA鎖交換反応の促進が重要であることを支持する。

相同組換えの中心的な反応であるDNA鎖交換はRad51リコンビナーゼによって触媒される。この反応では、まずDNA二重鎖切断末端がプロセッシングされてできた単鎖DNAにRad51が結合しヌクレオプロテインフィラメントを形成する。そして、この高次複合体が二重鎖DNAをキャッチし相同配列の検索、相同二重鎖とのDNA鎖交換反応をおこなう。我々はこれまでにRad51の活性化因子として分裂酵母Swi5-Sfr1複合体を同定した。本研究ではSwi5-Sfr1複合体が多段階反応であるDNA鎖交換の各段階にどのように作用するか調べるために、オリゴDNAの末端に蛍光基を付加し蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用して反応中間体形成と最終産物の生成をリアルタイムに観察する系を構築した。解析の結果、DNA鎖交換反応では二つの中間体を経て最終産物が生成されること。中間体の形成にはRad51のATP結合、中間体の遷移・最終産物の形成にはRad51のATPase活性が重要であることがわかった。更にSwi5-Sfr1複合体は、Rad51のATPase活性依存的に中間体の遷移・最終産物の生成を強く促進することが明らかになった。さらに、Rad51-単鎖DNAフィラメント表面に露出していると予想されるアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変異体を147種作製し、分裂酵母の遺伝学的性質を利用してSwi5-Sfr1との相互作用に特異的に欠損のあるRad51変異体を9種分離した。そのうち1種について解析を行った結果、野生型に比べATPase活性が遅くなり、Swi5-Sfr1複合体によって中間体の遷移・最終産物生成がほとんど促進されないことがわかった。この結果は生体内でもRad51のATPase活性にカップルしたSwi5-Sfr1複合体によるDNA鎖交換反応の促進が重要であることを支持する。