Roles of liquid-liquid phase separation in DNA double-strand break repair

Rad52は，酵母からヒトまで真核生物において広く保存されており，DNA二重鎖切断（DSB）損傷を修復する機構ではたらくと考えられている。酵母では，Rad52は修復の初期過程でDSBに集積し，Rad51タンパク質を損傷部位に呼び込んで修復反応を促進する。ヒト培養細胞においてもRAD52はDSB依存的に集積することが示されており，損傷部位へのRAD52の集積はDNA修復機構における重要なステップであることが考えられる。しかし，RAD52が損傷部位に集積する分子機構は不明な点が多い。そこで本研究では，ヒトRAD52がDNA損傷部位に集積する分子メカニズムとして液-液相分離が関与する可能性を検討した。ヒトRAD52の液滴形成をin vitroで検証するために，RAD52-GFPの大量調製系を確立した。それと並行してRAD52の天然変性領域内のlow complexity配列をアラニンに置換した変異体を複数種類作製し，野生型と同様の方法で液滴形成を検証した。RAD52-GFPを含む溶液はタンパク質凝集剤であるデキストランと混和することで透明な状態から濁った状態に変化した。この溶液にKClを加えると透明な状態に戻ることから，RAD52-GFPの凝集は可逆的であることがわかった。デキストランで凝集させたRAD52-GFPを蛍光顕微鏡で観察したところ，直径1~5 μmの球状の粒子が観察された。粒子を含む溶液に1,6-hexanediolを加えたところ，粒子が消失したことから，RAD52-GFPの液滴は液-液相分離によって形成されたことが強く示唆された。次に，low complexity配列に変異を導入したRAD52-GFPについても同様の解析を行った。その結果，RPA結合領域の近傍に変異を導入したRAD52-GFPにおいて，液滴形成能が野生型と比べ，顕著に低下していることがわかった。

Rad52は，酵母からヒトまで真核生物において広く保存されており，DNA二重鎖切断（DSB）損傷を修復する機構ではたらくと考えられている。酵母では，Rad52は修復の初期過程でDSBに集積し，Rad51タンパク質を損傷部位に呼び込んで修復反応を促進する。ヒト培養細胞においてもRAD52はDSB依存的に集積することが示されており，損傷部位へのRAD52の集積はDNA修復機構における重要なステップであることが考えられる。しかし，RAD52が損傷部位に集積する分子機構は不明な点が多い。そこで本研究では，ヒトRAD52がDNA損傷部位に集積する分子メカニズムとして液-液相分離が関与する可能性を検討した。ヒトRAD52の液滴形成をin vitroで検証するために，RAD52-GFPの大量調製系を確立した。それと並行してRAD52の天然変性領域内のlow complexity配列をアラニンに置換した変異体を複数種類作製し，野生型と同様の方法で液滴形成を検証した。RAD52-GFPを含む溶液はタンパク質凝集剤であるデキストランと混和することで透明な状態から濁った状態に変化した。この溶液にKClを加えると透明な状態に戻ることから，RAD52-GFPの凝集は可逆的であることがわかった。デキストランで凝集させたRAD52-GFPを蛍光顕微鏡で観察したところ，直径1~5 μmの球状の粒子が観察された。粒子を含む溶液に1,6-hexanediolを加えたところ，粒子が消失したことから，RAD52-GFPの液滴は液-液相分離によって形成されたことが強く示唆された。次に，low complexity配列に変異を導入したRAD52-GFPについても同様の解析を行った。その結果，RPA結合領域の近傍に変異を導入したRAD52-GFPにおいて，液滴形成能が野生型と比べ，顕著に低下していることがわかった。