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DNA二重鎖切断センサーKuタンパク質から探る温熱の生物作用の基本原理

利用 DNA 双链断裂传感器 Ku 蛋白探索热生物效应的基本原理

基本信息

批准号：
21659285
负责人：
松本義久
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659285/
关键词：
癌放射線温熱療法タンパク質変性 DNA修復 DNA-PK Ku DT40

项目摘要

私はこれまでに、DNA-PKの温熱処理で失活し、その原因はKuサブユニットにあること、温熱によるDNA-PK失活の起こり方は生物種によって異なることを明らかにしてきた。本研究は、44℃までの温熱処理がほとんど生存率に影響しないという特性を持つトリBリンパ球DT40細胞をホスト細胞として用いた遺伝子導入実験により、(1)温熱によるDNA-PK失活の生物種による違いの原因はKuの構造の違いによるものか、また、Ku86、Ku70のどちらに原因があるか、を明らかにする、(2)キメラタンパク質や点変異体の作製、解析により、温熱感受性に関係する構造的要因を探る、(3)温度感受性が異なるKuを発現する細胞における温熱放射線増感効果を検討することにより、温熱の放射線増感作用発現におけるKuの失活の寄与を評価する、ことを目的としている。まず、ホストとなるDT40のKu70およびKu80欠損細胞を入手し、Ku70およびKu80の発現状態やDNA損傷に対する応答性などを調べた。次に、ヒト、マウス細胞からRT-PCR法により、Ku86、Ku70の全長cDNAをクローニングした。なお、遺伝子導入の予備実験を行ったところ、これまでに哺乳類細胞で用いていたベクターおよび遺伝子導入法では、効率やタンパク質発現レベルに問題があったため、ベクターの改変や種々の遺伝子導入法の比較により、最適化を行った。DT40細胞でKu、あるいはDNA-PKのin situでの活性を見るのに簡便でよい方法は従来なかった。そこで、私が哺乳類細胞で見出したXRCC4のリン酸化を用いることを考案し、トリXRCC4遺伝子をクローニングした。その結果、現在データベースに登録されているトリXRCC4は部分断片で、重要な領域が欠けていたことが判明した。

DNA-PK inactivation due to heat treatment is caused by the presence of a host of biological species. In this study, the effects of 44℃ thermal treatment on the survival rate of DT40 cells were studied.(1) The causes of DNA-PK inactivation in biological species under thermal treatment were analyzed.(2) The causes of Ku86 and Ku70 cell survival were analyzed.(2) Study on the structural factors of temperature sensitivity, temperature The response to DNA damage is modulated by the presence of Ku70 and Ku80 cells in the DT40 and Ku80. The full-length cDNA of Ku86 and Ku70 was detected by RT-PCR. The preparation and implementation of gene introduction in mammalian cells are discussed in detail. The comparison and optimization of gene introduction methods in mammalian cells are discussed. DT40 cell line Ku, XRCC4 is an important component of mammalian cells. The result is that XRCC4 is partially fragmented and important.