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カルボヒドラーゼの基質認識と反応機構の解析

糖酶的底物识别及反应机制分析

基本信息

批准号：
04220204
负责人：
千葉誠哉
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04220204/
关键词：
アイソトープ効果親和標識活性部位カルボヒドラーゼ

项目摘要

(1)カルボヒドラーゼの加水分解反応に対するアイソトープ効果を調べた。酵素合成した[1,1'^<-2>H]-Iso-maltoseにに数種のα-グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを作用させ、速度パラメータを求め、[1,1'^<-1>H]-Isomaltoseに対する値と比較した。K_m値には変化が認められず、V_<max>のみが大きくなった。これらの結果はα-第二次アイソトープ効果の一例と考えられ、カルボニウムイオン中間体を経由する反応を示唆している。(2)自殺基質による糸状菌α-グルコシダーゼの親和標識反応を解析し、修飾部位(触媒基)を推定した。合成したConduritol B epoxide(CBEと略)を本酵素に作用させると、擬一次的に活性が減少した。この失活はMichaelis中間体経由のものであることが判明し、本酵素とCBEが等モルで反応することが認められた。部分修飾酵素のMaltoseに対する速度パラメーターを調べたところ、K_m値は変化せず、K_0のみが低下していた。拮抗阻害剤であるTrisにより、失活反応が完全に防御された。失活のpH依存性から得られたpK値は基質水解反応における酸性側の活性解離基(-C0O^-のpKe値と一致することから、CBEは解離型のカルボキシル基(触媒基)に結合すると推定された。CBEとカルボキシル基の間に形成されたエステル結合を加水分解し、遊離するInositolをscyllo-Inositolと同定した。CBE処理した酵素をLys-C Protease消化し、CBE標識ペプチドを得た。このペプチドの配列解析を行なったところ。Asp^<224>のみの収量が低下していた。NH_2OH処理によりCBEとカルボキシル基間のエステル結合を切断し、再び配列分析に供すると、収率の回復が認められた。従ってCBEの標識部位はAsp^<224>であり、この残基が本酵素の触媒基の一つであることが判明した。

(1) it is necessary to add water to decompose the water in the first place. Enzyme synthesis [1BI 1'^ & lt;-2>H]-Iso-maltose uses several kinds of alpha-amino acids, such as alpha, speed, Isomaltose, and so on. Knowledge.' The result of the second test was the result of a test, and the result of the second test was the result of a test. The result of the test was the result of a test. (2) "presumption" of the site (catalyst base) of α-mycobacteria from the base of the bacteria and the identification of the bacteria. Synthesis of Conduritol B epoxide (CBE abbreviation) this enzyme has the effect of reducing the activity of one-time enzyme. In the inactivated Michaelis, the body was identified by the enzyme CBE, and the enzyme was identified by the enzyme. Some of the enzymes were modified, such as Maltose, speed, temperature, temperature, speed, temperature, temperature Antagonism prevents Tris infection, and inactivation counteracts complete defense. The inactivation of pH-dependent antigens resulted in the inactivation of competitive antigens (- C0O^-pKe concordants), CBE cleavages (catalyst bases) in combination with the inactivation of antioxidants. The CBE system is based on the combination of the water decomposition and the Inositol scyllo-Inositol. CBE enzyme digestion, Lys-C Protease digestion and CBE labeling were successfully performed. I don't know how to parse the column. Asp ^ & lt;224> is very low in volume. NH_2OH is responsible for the monitoring of the CBE system and the combination of the cut-off device and the cut-off device, and then the analysis is arranged for the first time, and the rate of response is returned. The identification part of "CBE", "Asp ^ & lt;224> residue", "residue" of this enzyme, "catalyst", "catalyst", "identify".